动物组织样本DNA提取步骤

一、动物组织DNA提取设备准备

1、材料：动物组织

2、试剂：TIANGEN血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，无水乙醇等

3、设备：离心机，微量移液器等

二、动物组织DNA提取步骤

1、处理材料：取动物组织10 mg，尽量切碎，加200μL缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。

2、加入20μL蛋白酶K溶液，混匀后56℃水浴，直至组织溶解（不同组织裂解时间不同，通常需1-3小时即可完成）。简短离心以去除管盖内壁的水珠，再进行下一步骤。

3、加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁水珠。（溶解DNA）

注意：加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯。

4、加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15 s，此时可能出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。（沉淀DNA）

5、将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，12,000rpm（～13,400×g）离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。（吸附沉淀）

6、向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD（使用前先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（～13,400×g）离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

7、向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW（使用前先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（～13,400×g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

8、向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW，12,000 rpm（～13,400×g）离心30s，倒掉废液。（6、7、8为漂洗）

9、将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm（～13,400×g）离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的PCR等实验。

10、将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5 min，12,000 rpm（～13,400L×g）离心2 min，将溶液收集到离心管中。（溶解洗脱DNA）

注意：采用硅基质膜吸附的DNA，可将DNA在低盐高pH值条件下洗脱下来。pH值在7.0-8.5之间洗脱效率较高，pH值低于7.0则洗脱效率很低。

洗脱缓冲液体积不应该少于50μL，体积过小影响回收效率。为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2 min，12,000 rpm（～13,400×g）离心2 min。DNA产物应保存在-20℃，以防止DNA降解。