DNA染色法检测支原体操作步骤

一、实验准备

1、CO2培养箱、无菌小爬片。无菌培养皿、不含抗生素的完全培养液

2、二苯甲酰胺荧光染料浓缩液(50μg/ml)。称取5mg二苯甲酰胺荧光染料加入100 ml不含酚红和碳酸氢钠的Hanks平衡盐溶液中，在室溫下用磁力搅拌30~40 min,使完全溶解，-20℃避光保存。

3、二苯甲酰胺荧光染料工作液(0.5μg/ml)。取1 ml上述浓缩液，加至100ml无酚红和碳酸氢钠的Hanks溶液中，终浓度为0.5μg/ml。

4、固定液，即乙酸：甲醇(1:3)溶液为细胞固定液。

5、封片液。0.1mol/L枸橼酸22.2ml，0.2mol/L Na2HPO4·12H2O 27.8ml,丙三醇50.0ml，以上三者混匀，调pH至5.5。

6、不含酚红和碳酸氢钠的Hanks平衡盐溶液或PBS。经多种方法检测确定为支原体阴性的VERO细胞。

二、DNA染色法检测支原体操作步骤

1.无菌收集待测细胞上清：悬浮细胞离心后取上清液。

2.VERO细胞爬片：将小爬片无菌置于小培养皿内，滴加VERO细胞悬液(细胞浓度约3×104个/ml)2~3ml,置于CO2培养箱内培养24h使其贴壁。

3.制备标本。向6孔板内滴加待检细胞上清液约1ml,注意设立对照组（已证实的支原体阳性和阴性细胞上清液），培养48h后(VERO细胞汇合前）将细胞爬片从平皿中取出。

4.漂洗—将细胞爬片置于培养皿中，用不含酚红、NaHCO3的Hanks溶液（或PBS）漂洗3次。

5.固定—用乙酸：甲醇(1:3)固定液固定10 min。

6.漂洗—待固定液自然风干后用去离子水漂洗3次。

7.染色—置于Hoechst 33258工作液(0.5μg/ml)中染色10 min。

8.漂洗—去离子水中漂洗3次，每次1~2 min。

9.封片，紫外激发，观察。

三、实验结果判断

当阴性及阳性对照结果均成立时，结果有效。

1.阴性结果仅见待检细胞的细胞核呈现蓝色荧光。

2.阳性结果荧光显微镜下细胞周围或细胞膜表面可见大小不等、不规则的蓝色荧光小点和丝状点。

四、DNA染色法检测支原体注意事项

1.严格配制工作液及封片液。

2.保证作为指示细胞的VERO细胞没有被支原体污染。

3.必须同时设立阳性及阴性对照，注意重复，以排除假阳性和假阴性结果。4.应全面观察爬片，并注意可疑阳性的荧光点是凋亡小体还是支原体污染。

5.可适当调整荧光染料的工作浓度和染色时间，避免出现非特异性染色，如胞浆着色。