酵母单杂交实验详细步骤

一、构建诱饵菌株

1、制备YM4271感受态细胞

2、取上述感受态菌液，与1μg pHisi-cor promoter质粒混匀后加入预冷为0.2cm（electrode gap）电击转化杯（cuvette）中，置于冰上3min；

3、设置BTX电转仪的参数进行电转化（高压脉冲1.8kV）5ms；

4、吸出菌液后涂布至SD/Ura-平板，正置1小时，然后28℃倒置培养2-5天，待其长出明显的单菌落。

5、从平板上挑取单克隆落接种到2mL的液体SD/Ura-中，30℃振荡培养过夜OD600达0.6-1.0。

二、自激活验证

1、以上步扩大培养的菌株，进行感受态细胞制备

2、取该感受态菌液，与1μg pGADT7 AD质粒混匀后加入预冷为0.2cm（electrode gap）电击转化杯（cuvette）中，置于冰上3min；

3、设置BTX电转仪的参数进行电转化（高压脉冲1.8kV）5ms；

4、吸出菌液后涂布至SD/Ura-Leu-平板，正置1小时，然后28℃倒置培养2-5天，待其长出明显的单菌落。

5、从平板上挑取单克隆落接种到2mL的液体SD/Ura-Leu-中，30℃振荡培养过夜OD600达0.6-1.0。

6、配制含有不同浓度3-AT的SD/Ura-Leu-平板，浓度设置为10，15，20，50ug/ml。

7、按照五个稀释梯度，每滴2ul进行酵母点菌实验，28℃倒置培养3天，发现以上4个3-AT浓度梯度下，均无菌落生长，选择5ug/ml 3-AT作为后续互作验证筛选浓度。

三、转化诱饵菌株

1、以步骤1中扩大培养的cor promoter诱饵菌株，进行感受态细胞制备

2、取该感受态菌液，与1μg pGADT7-bHLH3质粒混匀后加入预冷为0.2cm（electrode gap）电击转化杯（cuvette）中，置于冰上3min；

3、设置BTX电转仪的参数进行电转化（高压脉冲1.8kV）5ms；

4、吸出菌液后涂布至SD/Ura-Leu-平板，正置1小时，然后28℃倒置培养2-5天，待其长出明显的单菌落。

5、从平板上挑取单克隆落接种到2mL的液体SD/Ura-Leu-中，30℃振荡培养过夜OD600达0.6-1.0。

相同方法转化cor promoter mutant诱饵菌株和jaz3 promoter诱饵菌株。

四、阳性对照酵母YM4271/pGADT7-P53/SV40复苏

1、取冻存的酵母YM4271/pGADT7-P53/SV40细胞，用接菌环在融化的菌液表面蘸一下，在SD/-Leu固体平板上划线，30℃倒置培养2天；

2、从平板上挑取单克隆落接种到液体SD/-Leu中，30℃振荡培养过夜至OD600达0.8

五、阴性对照酵母YM4271/pGADT7-lam/SV40复苏

1、取冻存的酵母YM4271/pGADT7-lam/SV40细胞，用接菌环在融化的菌液表面蘸一下，在SD/-Leu固体平板上划线，30℃倒置培养2天；

2、从平板上挑取单克隆落接种到液体SD/-Leu中，30℃振荡培养过夜至OD600达0.8

六、点菌

1、分别配制含有5ug/ml 3-AT的SD/-Leu/-his/-Trp平板和SD/-Leu/-Trp平板。

2、将步骤3~5中扩大培养的菌株，按照五个稀释梯度，每滴2ul进行酵母点菌实验，28℃倒置培养7天，进行扫描观察。