酵母双杂交常见问题及解决方法上

问题一：灭菌后酵母培养基颜色变成棕褐色怎么办？

SD系列的培养基预混了葡萄糖，在灭菌过程中由于灭菌时间较长，或者灭菌后在高温条件下长时间放置，引起培养基中葡萄糖碳化，导致颜色变深。通常情况下，对酵母培养不会产生较大影响（对个别毕赤酵母菌种影响较大），可以通过控制灭菌时间和灭菌温度来减少碳化程度，如118℃灭菌15分钟，并及时倒板。另外Coolaber产品中SC系列酵母培养基，不包含葡萄糖，需要将过滤除菌的葡萄糖加入灭菌后的酵母培养基中，这种方法配制的培养基，呈现透明偏白色。

问题二：酵母培养基不凝胶，或者凝胶硬度不够怎么办？

调整酵母筛选培养基的pH（5.8）;适当增加琼脂（建议量20g/L）。2019年后Coolaber公司出品的酵母培养基，只需要加入适量的去离子水，无需调pH，直接灭菌即可。

问题三：培养过程中酵母细胞变成粉色的可能原因。

培养基中腺嘌呤（Ade）浓度低；或酵母细胞代谢途径产生问题。一般通过往培养基中补加硫酸腺嘌呤（60mg/L）来改善这一情况。Coolaber所有酵母培养基均加入足够的腺嘌呤。实际操作中，酵母变粉色也并不影响蛋白间的相互作用。

问题四：酵母细胞生长慢怎么办？

可能原因：酵母表达的诱饵蛋白对细胞有毒害作用，影响酵母生长。

解决办法：可通过选择低敏感性的酵母菌株；或选用低拷贝数的表达载体。

问题五：诱饵蛋白对酵母细胞是有毒的，该怎样进行后续实验？

在液体培养基中培养不好的菌株可以在固体培养基上生长得很好。首先重悬克隆于1mL的SD/–Trp（PM2251），接着将重悬液平铺于5个100mm的SD/–Trp平板（PM2252），在30℃下温浴，直至平板上的克隆相互连在一起。用5mL 0.5X YPDA（PM2011）刮下每块板上的克隆，并收集到一管中，这样就可以使用这个细胞重悬液进行正常的杂交反应。

问题六：筛选培养基上克隆太多怎么办？

可能原因：可能诱饵蛋白存在自激活，自身就可以激活下游筛选标记的表达；或者是筛选条件过于宽松。

解决办法：选用更为严格的筛选条件抑制诱饵蛋白的自激活活性，如果效果不理想，可以删除诱饵蛋白能够引起自激活活性的结构域，再用于酵母双杂交实验。

问题七：筛选培养基上克隆太少怎么办？

可能原因：酵母杂交效率低；或筛选条件太严格

解决办法：延长杂交时间，提高杂交效率；放宽筛选条件。

问题八：酵母质粒提取比较繁琐，有没有好的替代方法？

Coolaber出品的酵母阳性克隆快速鉴定试剂盒（SK2420）仅仅需要高温加热酶解酵母菌3-5分钟就可以获取酵母质粒粗提物，完全可以用于PCR验证。

问题九：获得的阳性克隆，PCR检测有多条片段。

可能原因：一个酵母细胞可以包含多个捕获蛋白。

解决办法：选取单克隆划板2-3次，进行蓝白斑筛选，直到没有分离，找到阳性克隆，用于后续实验。

问题十：杂交效率不高，怎么办？

效率不高，可能是杂交细胞数量不够，可以适当增加诱饵蛋白的液体培养量，保证有足够的细胞数量。也可以延长杂交时间，直至通过显微镜镜检观察到存在三叶草形状的合子产生，再进行后续操作。