Tunel染色实验的常见问题与解决方法

问题一、荧光信号弱或没有荧光信号

原因1：样本处理不当

（1）样本切片太厚。建议适当将切片切薄一点，便于染色。

（2）脱蜡和水化不充分。建议脱蜡先60ºC 20 min，再使用二甲苯两次5-10 min；而水化用梯度乙醇从高到低浓度浸洗。

（3）Proteinase K的孵育时间过短。优化Proteinase K的孵育时间，常用时间10-30 min。4μm左右的片子孵育10 min，30μm左右的片子孵育30 min。

（4）Proteinase K浓度过低。建议蛋白酶K一般工作液浓度为20μg/mL。

（5）放置在-20ºC保存较长时间的切片不新鲜，减低染色效率。建议使用新鲜切片。

原因2：染色操作不当

（1）染色时间过短。建议一般37°c孵育60 min，可以根据凋亡损伤程度，可长至2 h，但要结合背景着色。

（2）TdT酶或荧光素/酶标记的dUTP浓度过低。建议适当提高TdT酶或荧光素/酶标记的dUTP浓度。

（3）TdT酶失活。建议TUNEL反应液临用前配制，短时间在冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导致TdT酶失活。

（4）样本干燥。加上TUNEL反应液后，请盖上盖玻片/保鲜膜/湿盒中进行，保证样本均匀染色，又可防止反应液干燥。

原因3：荧光检测操作不当

主要是因为操作未避光。由于荧光易碎灭，建议标记与检测样本时，载玻片要避光，观察时要尽量快。

问题二、非特异性染色（假阳性高）

原因1：样本处理不当

（1）使用酸性或碱性固定液，导致DNA损伤。建议使用pH中性的固定液固定组织或者细胞。

（2）固定液浓度过高，导致细胞自溶、DNA链不规则断裂、造成假阳性。建议使用4%多聚甲醛溶液（溶于PBS）。

（3）固定时间过长，导致细胞自溶、DNA链不规则断裂、造成假阳性。建议控制固定时间在4℃放置25 min。

（4）蛋白酶K处理时间过长，破坏核酸结构，出现假阳性。建议适当缩短处理时间。

（5）蛋白酶K浓度过大，破坏核酸结构，出现假阳性。建议适当调整蛋白酶K溶液浓度，一般工作液浓度为20μg/mL。

原因2：染色操作不当

（1）TUNEL染色时间过长。建议一般是37°c孵育60 min，可以根据凋亡损伤程度，可长至2 h，但要结合背景着色。

（2）未充分清洗样本。染色后PBS清洗次数可增加到5次，来避免切片的非特异性染色。

问题三、荧光背景强

原因1：样本操作不当

（1）TUNEL染色时间过长。建议染色时间适当，一般是37°c孵育60 min，避免串色。

（2）TUNEL染色液浓度过大。建议增大稀释倍数，优化浓度。

（3）PBS未充分清洗样本。在TUNEL反应后PBS清洗次数可增加到5次，来避免切片样本中残留的染料。

原因2：荧光检测操作不当

曝光时间过长。建议调整曝光条件，先对阴性组调整到无背景光，然后用这个曝光条件去拍摄实验组（可以微调，但是不需要大调）。