荧光定量PCR实操注意事项

1、荧光定量PCR操作注意点：

（1）实验室注意分区：试剂准备间，样本处理间，PCR室，电泳间要有明确区分，各房间实验室的实验服不得混用；

（2）试剂准备间及样本处理间不处理实验相关的高浓度的核酸模板（如高浓度的标准品，PCR产物，miRNA的minics等）；

（3）减少频繁多次的走动，尤其去过电泳间之后当天不可进入其他房间；

（4）使用生物安全柜加样，不同位置的移液器不可混用，不要随意更换其位置；

（5）在检测体系中添加UNG酶系统用于避免PCR产物的污染。

2、试剂质量控制：

对每批次配制或购买的试剂进行质检，保证试剂的性能稳定可控，均一。

3、试剂使用注意事项：

试剂使用前必须混匀。

4、移液器操作注意事项：

使用结束后调整至大量程，取样时枪头深入页面的深度尽量一直保持在1-2 mm之间，避免外壁沾过多试剂随加样进入导致重复性不好。

5、反应液配制及注意事项：

加样使用合适量程的移液器；对于较小体积的移液，取液时候，不可深入液体太多以免试剂沾到吸头外壁至移液量不准确，深入1-2 mm即可（尤其是粘稠试剂，如酶，甘油等）；

小体积试剂加样务必：取液后眼观是否取到液体，加样务必浸入混合液以下吹吸数次，弃吸头前眼观确定吸头中无残留。

6、反应液分装及注意事项：

反应液分装前必须混匀（比如涡旋震荡或移液器吹吸混匀）再分装；反应液第一个孔分装必须润一下枪头，96孔之间加样间隔时间尽量保持一致，96孔的点样位置尽量保持在96孔的相同位置，复孔之间尽量相邻点样，点样按照一定的顺序，吸取时枪头深入页面的深度尽量一直保持在1-2mm之间；

加样使用移液器镶紧移液器吸头，每次按至第一档即可，不可按至第二档，避免气泡产生和加样不准确（注：这个并不是使加样准确的方式，只要保持所有孔的加样方式相同，可减少加样误差；）加样尽量匀速，不要加样到孔外面，以免对后面封膜造成影响。