实时荧光定量PCR常见问题及解决方法

1、RNA得率低

原因1：样品裂解不完全

解决：适当选择起始材料的量，加入合适体积的裂解液。

原因2：匀浆不充分

解决：减少材料的数量;根据材料类型选择合适匀浆方法;组织样本适宜切成小块后，在Trizol试剂中均质，充分裂解。

原因3：用于分光光度分析的稀释液PH值太低

解决：使用TE（PH 8.0）作为稀释液进行读数测定。

2、RNA降解

问题1：RNA酶污染

解决：戴上手套操作，勤换手套;耗材与试剂均应作RNase-free处理;操作中减少EP管的开盖次数与时间。

问题2：样品处理不当

解决：新鲜组织收获后，立即冻结在-70℃或液氮中;也可以在Trizol试剂中均质后，-70℃下储存。

3、Abs260/Abs280比值低

问题1：酸性pH降低吸光度比率

解决：使用TE缓冲液(pH 8.0)作为稀释液进行测定。

问题2：水相被酚相污染

解决：小心转移上层水相，避免吸入中间相，可留少许上层相不吸取。

4、DNA污染

问题1：Trizol加少了，造成DNA/核蛋白复合物与RNA水相分离不完全

解决：适当选择起始材料的量，加入合适体积的裂解液。

问题2：水相被苯酚相污染

解决：小心转移上层水相，避免吸入中间相，可留少许上层相不吸取。

5、下游反应中RNA表现不佳

问题1：乙醇或盐类污染

解决：溶解RNA之前，注意洗涤沉淀，并通过空离和风干除去残留。

6、熔解曲线有杂峰

问题1：引物二聚体

解决：

（1）提高退火温度

（2）降低引物浓度，甚至调整正向引物和反向引物的比例。一般引物最终浓度设定为200 nM，但如有必要，可降低至60 nM。

（3）镁离子的浓度最好在3 mM左右。高于这个浓度，引物二聚体更易形成;

（4）重新设计引物并评估它们的二聚化倾向。

问题2：非特异性扩增

解决：重新设计引物并通过预实验评估特异性。

问题3：cDNA模板降解

解决：模板避免反复冻融，可适当分装保存，每次取用一小管。

7、无扩增信号

原因：低表达，反转录，或定量仪器问题