Southern Blot印迹杂交实验操作步骤

一、Southern Blot待测核酸样品的制备

1、制备待测DNA

基因组DNA是从动物组织（或）细胞制备。1.采用适当的化学试剂裂解细胞，或者用组织匀浆器研磨破碎组织中的细胞；2.用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白质和RNA；3.用有机试剂（酚/氯仿）抽提方法去除蛋白质。

2、DNA限制酶消化

基因组DNA很长，需要将其切割成大小不同的片段之后才能用于杂交分析，通常用限制酶消化DNA。消化DNA后，加入EDTA，65℃加热灭活限制酶，样品即可直接进行电泳分离，必要时可进行乙醇沉淀，浓缩DNA样品后再进行电泳分离。

二、琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品

1.制备琼脂糖凝胶，尽可能薄。

2.分子质量标志物（DIG标记）上样。

3.电泳，使DNA条带很好的分离。

4.评价靶DNA的质量。在电泳结束后，0.25-0.50μg/mlEB染色15-30min，紫外灯下观察凝胶。

三、电泳凝胶预处理

1.如果靶序列>5kb，则需进行脱嘌呤处理。

(1)把凝胶浸在0.25mol/L HCl中，室温轻轻晃动，直到溴酚蓝从蓝变黄。

注意：处理人类基因组DNA≤10分钟；处理植物基因组DNA≤20分钟。

(2)把凝胶浸在灭菌双蒸水中

2.如果靶序列<5kb，则直接进行下面的步骤

(1)把凝胶浸在变性液（0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl）中，室温2×15分钟，轻轻晃动。

(2)把凝胶浸在灭菌双蒸水中

(3)把凝胶浸在中和液中（0.5mol/L Tris-HCl，pH7.5，1.5mol/L NaCl），室温2×15分钟。

(4)在20×SSC中平衡凝胶至少10分钟。

四、转膜

将凝胶中的单链DNA片段转移到固相支持物上。而此过程最重要的是保持各DNA片段的相对位置不变。DNA是沿与凝胶平面垂直的方向移出并转移到膜上，因此，凝胶中的DNA片段虽然在碱变性过程已经变性成单链并已断裂，转移后各个DNA片段在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置仍然一样，故而称为印迹（blotting）。

五、探针标记

用于Southern印迹杂交的探针可以是纯化的DNA片段或寡核苷酸片段。探针可以用放射性物质标记或用地高辛标记，放射性标记灵敏度高，效果好；地高辛标记没有半衰期，安全性好。

六、预杂交（prehybridizafion）

将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交之前，必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭，这就是预杂交的目的。

（一）配制预杂交液。

（二）把预杂交液放在灭菌的塑料瓶中，在水浴中预热至杂交温度。

（三）将表面带有目的DNA的硝酸纤维素滤膜放入一个稍宽于滤膜的塑料袋，浸湿滤膜。

（四）将DNA置沸水浴中10min，迅速置冰上冷却1-2min，使DNA变性。

（五）从塑料袋中除净2×SSC，加入预杂交液，按每平方滤膜加0.2ml。

（六）加入变性的DNA置终浓度200μg/ml。

（七）除净袋中的空气，用热封口器封住袋口摇晃数次以使其混匀，置于42℃水浴中温育4h。

七、Southern杂交

1、将标记的DNA探针置沸水浴10min，迅速置冰上冷却1-2min，使DNA变性。

2、从水浴中取出含有滤膜和预杂交液的塑料袋，将变性的DNA探针加到预杂交液中。

3、除去袋中的空气封住袋口，为避免同位素污染水浴，将封好的杂交袋再封入另一个未污染的塑料袋内。

4、置42℃水浴温育过夜（至少18h）。

八、洗膜

取出NC膜，在2×SSC溶液中漂洗5min，然后按照下列条件洗膜：

2×SSC/0.1%SDS，42℃，10min；

1×SSC/0.1%SDS，42℃，10min；

0.5×SSC/0.1%SDS，42℃，10min；

0.2×SSC/0.1%SDS，56℃，10min；

0.1×SSC/0.1%SDS，56℃，10min。

采用核素标记的探针或发光剂标记的探针进行杂交还需注意的关键一步就是洗膜。

九、放射性自显影检测

（一）将滤膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏）。

（二）在暗室内，将2张X光底片放入曝光暗盒，并用透明胶代固定，合上暗盒。

（三）将暗盒置-70℃低温冰箱中使滤膜对X光底片曝光（根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天）。

（四）从冰箱中取出暗盒，置室温1-2h，使其温度上升至室温，然后冲洗X光底片（洗片时先洗一张，若感光偏弱，则在多加两天曝光时间，再洗第二张片子）。（注：注意同位素的安全使用）