阴离子交换色谱纯化从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶回收的DNA
原理从琼脂糖凝胶中回收的 DNA 片段，如 PCR 产物或酶切 DNA 片段，对进一步酶切具有一定的抗性。这种抗性产生的原因是多方面的，通常将其归为抑制剂的存在
原理
从琼脂糖凝胶中回收的 DNA 片段，如 PCR 产物或酶切 DNA 片段，对进一步酶切具有一定的抗性。这种抗性产生的原因是多方面的，通常将其归为抑制剂的存在。经带正电荷的离子交换树脂纯化的双链 DNA 可有效去除样品中的抑制剂。在低离子强度的缓冲液中，带负电的 DNA 结合到带正电的基质上，如 DEAE-Sephacel 或 DEAE-Sephadex，污染物被洗脱，然后通过提高缓冲液的离子强度，将 DNA 从基质上洗脱下来。由于质粒 DNA 以及单链 DNA-经与基质结合很难洗脱，因此不宜采用 DEAE 树脂纯化。
材料与仪器
DNA 样品
乙醇 异丙醇 酚 氯仿 TE
一次性小柱子或 2 ml 注射器 树脂、预溶胀的 DEAE-纤维素或 DEAE-Sephacel
乙醇 异丙醇 酚 氯仿 TE
一次性小柱子或 2 ml 注射器 树脂、预溶胀的 DEAE-纤维素或 DEAE-Sephacel
步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
乙醇
异丙醇
酚：氯仿（1:1, V/V)
TE ( pH 7.6)
TE ( pH 7.6) 含 0.1 mol/L NaCl
TE ( pH 7.6) 含 0.2 mol/L NaCl
TE ( pH 7.6) 含 0.3 mol/L NaCl
TE ( pH 7.6) 含 0.6 mol/L NaCl
2. 核酸与寡核苷酸
DNA 样品应溶于 TE ( pH 7.6) 中
3. 专用设备
一次性小柱子或 2 ml 注射器
树脂、预溶胀的 DEAE-纤维素或 DEAE-Sephacel
二、方法
1. DEAE 悬浮在 20 倍体积含 0.6 mol/L NaCl 的 TE ( pH 7.6)中。待树脂沉降后，吸去上清。再加 20 倍体积含 0.6 mol/L NaCl 的 TE ( pH 7.6)，轻轻地将树脂重新悬浮起来。树脂重新沉降后，吸去大部分上清液。平衡后的树脂可于 4℃ 保存。
2. 取 0.6 ml（足以结合 20 μg DNA) 的 DEAE 悬浮液装一小柱或 2 ml 注射器针筒。
3. 分别用下述溶液洗柱：
0.6 mol/L NaCl 的 TE ( pH 7.6) 3 ml，TE ( pH 7.6) 3 ml，0.1 mol/L NaCl 的 TE ( pH 7.6) 3 ml。
4. 将 DNA ( 溶于 pH 7.6 的 TE 中）与等体积含 0.2 mol/L NaCl 的 TE ( pH 7.6) 混合，混合液上样到层析柱上，收集流出液重新上柱。
5. 1.5 ml 含 0.3 mol/L NaCl 的 TE ( pH 7.6) 洗柱 2 次。
6. 0.5 ml 含 0.6 mol/L NaCl 的 TE ( pH 7.6) 洗脱 DNA, 共 3 次。
7. 用酚: 氯仿抽提洗脱液 1 次。
8. 将水相等体积的分装在两个微量离心管中，每管加等体积的异丙醇，室温放置 15 min, 于 4℃ 最大转速离心 10 min 回收 DNA。
9. 用 70% 乙醇小心清洗沉淀，将离心管口打开，置操作台上数分钟使乙醇挥发。然后将 DNA 重溶于小体积（3~5 μl) TE ( pH 7.6) 中。
10. 通过聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳对 DNA 片段进行定性和定量。
(1) 将少量（估计含有 20 ng) 最终制备的 DNA 片段与 10 μl TE ( pH 8.0) 混合，加 2 μl 所需的凝胶载样缓冲液。
(2) 加样并在适当浓度的聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶上进行电泳，以已知量的经用适当限制酶消化的原 DNA 作为标准参照物。分离的 DNA 片段应与限制酶消化物中的正确片段同步迁移。
(3) 仔细检査凝胶，看是否有弱荧光带存在。弱荧光带的存在表明有 DNA 污染。通过分离片段与标准参照物的相对荧光强度，常可估计最终制品中的 DNA 量。
极少数情况下，回收的 DNA 还需作进一步纯化。最好的方法是再次采用 DEAE-Sephacel 层析法或采用不同厂家提供的特异性树脂。很多树脂都是预先制成一个小柱子，适合用微量离心机来纯化少置的 DNA。与环状质粒 DNA 相比，树脂更宜于纯化线状 DNA 分子。
1. 缓冲液和溶液
乙醇
异丙醇
酚：氯仿（1:1, V/V)
TE ( pH 7.6)
TE ( pH 7.6) 含 0.1 mol/L NaCl
TE ( pH 7.6) 含 0.2 mol/L NaCl
TE ( pH 7.6) 含 0.3 mol/L NaCl
TE ( pH 7.6) 含 0.6 mol/L NaCl
2. 核酸与寡核苷酸
DNA 样品应溶于 TE ( pH 7.6) 中
3. 专用设备
一次性小柱子或 2 ml 注射器
树脂、预溶胀的 DEAE-纤维素或 DEAE-Sephacel
二、方法
1. DEAE 悬浮在 20 倍体积含 0.6 mol/L NaCl 的 TE ( pH 7.6)中。待树脂沉降后，吸去上清。再加 20 倍体积含 0.6 mol/L NaCl 的 TE ( pH 7.6)，轻轻地将树脂重新悬浮起来。树脂重新沉降后，吸去大部分上清液。平衡后的树脂可于 4℃ 保存。
2. 取 0.6 ml（足以结合 20 μg DNA) 的 DEAE 悬浮液装一小柱或 2 ml 注射器针筒。
3. 分别用下述溶液洗柱：
0.6 mol/L NaCl 的 TE ( pH 7.6) 3 ml，TE ( pH 7.6) 3 ml，0.1 mol/L NaCl 的 TE ( pH 7.6) 3 ml。
4. 将 DNA ( 溶于 pH 7.6 的 TE 中）与等体积含 0.2 mol/L NaCl 的 TE ( pH 7.6) 混合，混合液上样到层析柱上，收集流出液重新上柱。
5. 1.5 ml 含 0.3 mol/L NaCl 的 TE ( pH 7.6) 洗柱 2 次。
6. 0.5 ml 含 0.6 mol/L NaCl 的 TE ( pH 7.6) 洗脱 DNA, 共 3 次。
7. 用酚: 氯仿抽提洗脱液 1 次。
8. 将水相等体积的分装在两个微量离心管中，每管加等体积的异丙醇，室温放置 15 min, 于 4℃ 最大转速离心 10 min 回收 DNA。
9. 用 70% 乙醇小心清洗沉淀，将离心管口打开，置操作台上数分钟使乙醇挥发。然后将 DNA 重溶于小体积（3~5 μl) TE ( pH 7.6) 中。
10. 通过聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳对 DNA 片段进行定性和定量。
(1) 将少量（估计含有 20 ng) 最终制备的 DNA 片段与 10 μl TE ( pH 8.0) 混合，加 2 μl 所需的凝胶载样缓冲液。
(2) 加样并在适当浓度的聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶上进行电泳，以已知量的经用适当限制酶消化的原 DNA 作为标准参照物。分离的 DNA 片段应与限制酶消化物中的正确片段同步迁移。
(3) 仔细检査凝胶，看是否有弱荧光带存在。弱荧光带的存在表明有 DNA 污染。通过分离片段与标准参照物的相对荧光强度，常可估计最终制品中的 DNA 量。
极少数情况下，回收的 DNA 还需作进一步纯化。最好的方法是再次采用 DEAE-Sephacel 层析法或采用不同厂家提供的特异性树脂。很多树脂都是预先制成一个小柱子，适合用微量离心机来纯化少置的 DNA。与环状质粒 DNA 相比，树脂更宜于纯化线状 DNA 分子。
相关文章
