嵌套缺失和互补寡核苷酸进行接头分区诱变

1.  用Bal 31或外切核酸酶Ⅲ及S1核酸酶在质粒的目的区域产生一嵌套式的5’或3端'缺失突变体。首先在目的序列附近用一限制酶使质粒线性化，在用Bal 31消化时，应确定其切割效率，以便弄清毎切割6~8个目的碱基对和覆盖待诱变区所需的时间。

 

2.  将合成接头与经适当时间酶切处理的DNA连接。用适当的限制酶进行切割以产生在缺失末端上带有接头而在另一端上含有载体位点的片段。

3.  用低熔点琼脂糖凝胶分离目的片段，将该片段与载体片段相连，以产生带缺失突变的完整质粒。

4.  用连接混合物转化合适的大肠杆菌，挑克隆，小量制备质粒DNA。

5.  用限制性内切酶消化小量制备的质粒DNA，以产生一端含缺失终点的小DNA片段，进行非变性聚丙烯酰胺或筛分型琼脂糖凝胶电泳来确定DNA片段的大小，以此说明缺失突变末端的存在。选择适当的限制性酶以便获得 200~300 bp 小片段。

6.  对目的区域内成套的缺失突变体测序，以确定准确的缺失终点。

7.  设计互补寡核苷醆，以恢复位于每一缺失末端的接头与5’系列缺失体的上游限制性酶切位点之间或者位于接头与3’系列缺失体的下游切点间的野生型序列。