SSR标记实验步骤

取叶片→磨样→提取DNA→PCR扩增→电泳检测→染色→读带标记。

1、DNA提取

按照Doyle和Dickson（1987）CTAB法（`Cetyl triethyl ammonium bromide）并略加改进的程序进行，具体步骤如下：

①  成熟期取叶片加液氮研磨成粉末状，转入1.5ml离心管中，-20℃冰箱保存；

②  加入600μl 65℃的2×CTAB混匀并置于65℃水浴中保温30-60分钟；

③  取出，冷却，上下摇匀后，加入600微升24:1的氯仿异戊醇；

④  12000转/分钟离心10分钟，取上清液于另一个1.5ml的离心管中；

⑤  加异丙醇，12000转/分钟离心10分钟，倒掉上清液；

⑥  干后用100%的洒精清洗，干后加适量TE。2、PCR扩增

模板DNA的浓度大约25ng/μl,扩增反应体系为20μl。具体如下：

Sterile ddH2O        11μl

PCR Buffer              3μl

dNTP-mix                 0.5μl

Primer1                     1μl

Primer2                     1μl

Taq polymerase      0.5ul（2U/μl）

DNA                            3μl  

PCR扩增程序为：（2h30min）  

①  预变性：94℃，5分钟；

②  变  性：94℃，40秒；

③  退  火：55℃  40秒；

④  延  伸：72℃，1分钟；

⑤  循  环：从2到4共38个循环；

⑥  72℃下最后延伸5分钟；4℃ 5min，扩增产物置于4℃的冰箱保存。3、扩增产物的电泳分离

制胶→灌胶→上样→电泳。

扩增产物用8%的聚丙烯酰胺变性胶电泳分离，步骤如下：

①  准备电极液（1×TBE）；

②  将梳子拨出，并迅速用电极液冲洗胶面；

③  不预电泳；

④  点样，电泳220V；

⑤  拆板，并及时将内板、边条及梳子洗净。

4、凝胶染色

①  固定：10%醋酸，5分钟；

②  染色：10分钟；

③  漂洗：dH2O，5-10秒；

④  显色：甲醛-NaOH，直到满意为止；

⑤  漂洗：dH2O，2分钟。

 5、自封带封胶，读带标记，数码照相摄像，室温风干。

1、优点：

（1）标记数量丰富，具有较多的等位变异，广泛分布于各条染色体上；

（2）是共显性标记，呈孟德尔遗传；

（3）技术重复性好，易于操作，结果可靠。

2、缺点：

开发此类标记需要预先得知标记两端的序列信息，而且引物合成费用较高。