基因工程操作技术及原理之基因克隆

1．克隆已知序列的基因

根据已知基因的序列设计引物(primer)，利用PCR方法克隆基因。即使不同种属之间，基因编码区序列的同源性高于非编码区的序列。在某种植物的同源基因被克隆的条件下，可先构建eDNA文库或基因组文库，然后以该基因(或部分序列)为探针来筛选目的基因的克隆。

2．功能克隆

根据基因的产物蛋白质克隆基因，利用这种方法分离基因，首先应根据已知的生化缺陷或特征确认与该功能有关的蛋白质，再分离纯化这一蛋白并制备相应抗体；或测定其氨基酸序列，推测可能的mRNA序列，根据mRNA序列设计相应的核苷酸探针或寡核苷酸引物。利用抗体或核苷酸探针筛选基因组DNA文库或cDNA文库，也可利用寡核苷酸引物对核DNA或cDNA进行PCR扩增。通过对阳性克隆或PCR扩增产物的序列分析鉴定分离基因。

3．作图克隆

作图克隆又称图位克隆，是随着分子标记图谱的建立而发展起来的基因克隆技术。根据连锁图谱定位的基因来克隆目的基因。作图克隆是从连锁标记出发，通过大片段克隆(BAC库或YAC库)的染色体步移(chromommewalking)到达靶基因。

4．表型差异克隆

利用表型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆基因，对于有些植物的性状，既不了解它们的基因产物也没有对它们进行基因定位，但已知它们的表型存在差异，利用这些差异，用下述方法也可克隆植物基因。

(1)消减杂交法 即消减杂交法(subtractive hybridization)是通过鉴定两个mRNA间差异而分离基因的方法。其基本方法是：提取两种差异细胞或组织的DNA后，反转录合成cDNA，并用限制性内切核酸酶切割成小片段。

将其中一个样品的酶切产物分成两份，分别连接不同的含有特定酶切位点的40bp左右的寡核苷酸接头，作为检测者(tester)。用另外一个样品过量的酶切产物作为驱动者(driver)与带有不同接头的tester进行第一次杂交。将获得的第一次杂交产物混合，同时加入新的变性driver进行第二次杂交，杂交完全后补平接头。加入以两种接头序列设计的单链寡核苷酸引物，对杂交补平后的产物进行PCR扩增，获得目的基因。

(2)DNA标签法(DNAtagging) 又称转座子标签(transposontagging)、T―DNA标签(T―DNAtagging)和反转录转座子标签(retrotransposontagging)。所有的标签技术都基于标签序列的已知性。

该法是利用转座子或T―DNA插入生物的基因组中引起某一基因失活产生一些突变体，然后用相应转座子或T―DNA对突变体文库进行筛选，以筛选到的阳性克隆片段为探针，再筛选野生型生物基因文库分离目的基因。

(3)差别显示技术(differentialdisplay) 包括mRNA差别显示法、基因表达连续分析法、代表性差式分析法、抑制消减杂交法、有序差异显示、基因表达指纹、标签接头竞争PCR、基因组差异显示、cDNA3，端限制性酶切片段显示等。

(4)缺陷互补和反义mRNA技术 缺陷互补就是利用某一给定的cDNA文库，通过遗传转化来补充宿主特定的代谢基因缺陷，获得目的基因的方法。

反义mRNA技术是依据所要抑制表达的基因，人工设计合成的反义基因转化宿主后，在宿主中转录成mRNA，即反义mRNA。这种反义mRNA能与原基因所转录出来的mRNA互补，当其剂量远大于原基因所转录出来的mRNA时，就形成复合体。这种复合体不能进行跨核孔运输，也就抑制了宿主基因的表达。这样，通过表型的变化就可以判断基因的功能，从而克隆到此基因。

(5)cDNA微阵歹，J和基因芯片技术 是利用原位合成法或将已合成好的一系列寡核苷酸或cDNA固定在介质上，制备成低密度或高密度的寡核苷酸阵列。利用这样的芯片，与不同条件下从某种生物体中转录出来的并被标记的所有mRNA杂交，通过分析杂交位点信号的强弱进而找出目的基因。常用于基因的表达分析及基因分离。

5．染色体大片段基因克隆

利用酵母或细菌制备人工染色体基因组文库，从中克隆基因，如酵母双杂交体系可以分离能与已知的靶蛋白质相互作用的蛋白质的编码基因