DNA文库的构建及其筛选
原理高等植物基因组的一个显著特征是其内含有大量的 DNA 重复序列, 重复序列常位于异染色质区, 因此可能与染色体的结构有关 . 季静等根据国际上 对基因组、染
原理
高等植物基因组的一个显著特征是其内含有大量的 DNA 重复序列, 重复序列常位于异染色质区, 因此可能与染色体的结构有关 . 季静等根据国际上 对基因组、染色体、结构蛋白的研究前沿, 提出染色体 DNA 平均每隔 30 kb 或螺线管平均 250 nm 存在 着特异重复序列, 称为 YR DNA ( Yielding repeat DNA) 。
材料与仪器
DNA
升汞 MS培养基 琼脂糖 EcoR I Hind III BamH I Bg lII Pst I
电泳仪 尼龙膜
升汞 MS培养基 琼脂糖 EcoR I Hind III BamH I Bg lII Pst I
电泳仪 尼龙膜
步骤
1.水稻 DNA 的提取水稻 DNA 的提取参照 Dellaporta, Wood 和 Hicks (1983) 法分离总基因组DNA并略有修改。 通过 0.8% 琼脂糖凝胶电泳测定分子量。
2.基因文库的构建。以限制性内切酶γEcoRI 消化水稻基因组 DNA12 h, 然后从胶中回收 0.5~ 8kb片段, 连接到γExCell EcoR I/ CIP载体上, 体外包装并感染受体菌NM522。
3.基因文库的鉴定。挑取 50个新鲜的白色噬菌斑, 分别加入 150ul SM buffer , 按γExCell 试剂盒说明书进行质粒释放, EcoRI 酶切鉴定基因组 DNA 插入片段的大小。
4.水稻基因组。DNA 的非同位素标记标记程序按地高辛标记检测试剂盒探针标记程序进行。
5.噬菌斑原位杂交。噬菌斑转膜、固定均参照分子克隆方法 。预杂交, 杂交以及高灵敏度的洗涤尼龙膜均在杂交炉 (Biometra) 中进行。杂交信号的检测按照 Boehringer Mannheim 的使用说明书进行。
6.点渍杂交。选取噬菌斑原位杂交信号较强的 200 个克隆进行质粒释放。 质粒释放程序参照γExCell 试剂盒说明书进行。 然后按碱裂解法小量提取重组质粒。将 200 个重组 DNA 各取 1ul 依次点在尼龙膜 上, 固定后以 Dig 标记的基因组 DNA 为探针进行点渍杂交。 从中选取 40 个杂交信号较强的重组子, 再次进行斑点杂交。
7.Southern 杂交。选取第三轮点渍杂交信号强的 10 个重组子标记为探针. 基因组 DNA 酶切采用 5 种常用的限制性内切酶: EcoRI、H indIII、BamH I、Bg lII 和 PstI。常规琼脂糖凝胶电泳分离, 通过电转 移仪将酶切片段从琼脂糖凝胶中转移到尼龙膜进行 Southern 杂交。
注意事项
产生 DNA片段的方法要求切点随机性高，使任一基因都可能被完整地克隆，并且最好在两侧都留有粘性末端以利于 DNA片段间的连接。机械剪切方法的优点是随机性高，可是所得片段两端没有粘性末端，有时较为不便与载体连接。用限制性核酸内切酶酶解的随机性较差，但是两端有粘性末端,便于和载体相连接。
常见问题
因文库的保存和利用 为了有效地保存基因文库，可通过细菌的繁殖而使包含各个特定 DNA片段的细菌增多。液体培养不适用于这一目的，因为各个细菌的生存和繁殖能力不同，各个克隆被保存的机会也会因此而不相等。在固体培养基上每一个细菌单独形成一个菌落，各个细菌并不相互干扰和竞争，因而有利于全部克隆的保存。形成的每一个菌落中大约包含107个细菌，这样一个基因文库中的所有的克隆几乎都扩增了107倍。把培养皿上的细菌全部洗下加以保存，便可以在需要时从中取得任何一个克隆。
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