引物介导的原位标记技术

一、标准一步反应

PRINS 技术的操作规程有两套，一套和 FISH 技术一样，将样本在热甲酰胺中变性，然后按 3.4 立即在系列梯度冰冷乙醇中淬火。或按下面的叙述通过将标本和反应混合物共同加热到变性温度将样本变性：

1.确定玻片有多大区域需要分析，选择适合该区域的盖玻片和一定数量的反应混合物。每毫米长度的盖玻片用 1ul 的反应混合物。准备 6(VL 反应混合物完全覆盖标准的玻片，并盖上 24 mmX60 mm 的盖玻片。对于较小的区域就要用较少量的反应混合物和较小的盖玻片。

2.当反应混合物随着盖玻片展开的时候，将做好的标本放在有盖子的电热恒温板上 94°C、4 min 变性（见注释 4)。

3.将标本迅速转移到 55~65°C 孵育 5~60 min，用于探针退火及链延伸。简单重复序列的探针退火快，探针越复杂退火越慢，链的延伸实际上是瞬间完成的，因此退火时间决定孵育的时间。

4.将标本放到预热到 55~65°C 反应终止液中 1 min，终止 PRINS 反应。

5.将标本转移至 50 mL 的洗脱液中，室温洗脱大约 3 min(实验可以在这一步暂停，可以将标本在洗脱液中 4°C 放置过夜)。

6a.如果使用了荧光素标记核苷酸，现在就可以将标本复染、封片并在显微镜下计数分析。

6b.如果使用了地高辛标记核苷酸，需要按 3.6 将其用抗地高辛的抗体显色。

二、ddPRINS

将 PRINS 过程中，在正确杂交探针进行 DNA 合成时所不需的核苷酸种类替换为相应的双脱氧核苷酸即可（如当合成人端粒元件 CCCTAA 时用 ddGTP 替换 dGTP)。

三、组合标记

组合标记有两个主要的不同策略，先进行 PRINS 反应或后进行 PRINS 反应。在 PRIN^FISH 中，PRINS 要先进行，这样可以避免 FISH 探针参与 PRINS 反应，FISH 探针应在标本已用冰冷乙醇淬火后再加入。避免标本在 PRINS 检测后再变性非常重要，因为标本变性会导致 PRINS 信号消失。而在 PRINS-免疫染色中，PRINS 应后进行。免疫染色后将标本在 2% 多聚甲醛中室温固定 2 min，并在 PRINS 操作前用系列乙醇梯度（70%、90% 和 99%) 脱水以提高免疫染色的存在。

四、已变性样本上的 PRINS

如果只能使用甲酰胺变性的标本，如恒温装置不足以提供加热变性的温度，标本在 70% 甲酰胺中 70°C 变性 2 min，或参考所在实验室 FISH 技术变性的标准程序进行变性。如果前面已经进行了 PRINS 的操作，标本可能已经处于变性状态。在这些情况下，将标本立即放入一 20°C 系列乙醇梯度中淬火以使目标 DNA 保持变性结构状态非常重要。

1.变性后应尽可能快的将标本放入-20°C 系列梯度乙醇（70%、90% 和 99%) 中脱水各 3 min。

2.将标本从 99% 乙醇中移出，沥尽液体。

3.在上述步骤操作过程中准备反应混合物。如果该反应是第二个 PRINS 反应，确保这次使用的是不同标记的 dNTP。

4.退火及链延伸：将样本在 55?65°C 预热 lmin。然后将同样预热的反应混合物加在标本上并随着盖玻片蔓延开。

5.和前面的操作一样进行孵育、终止和洗脱。这时的标本就已经准备好，可以进行抗体染色及复染/封片。

6.如果需要进行第三次 PRINS 反应，重复步骤 1?5。

五、自身引物介导的原位标记（SPRINS)

SPRINS 可以按照上面步骤 2?5 进行操作（标本在任何一步不能进行变性操作，因此不需要第 1 步）。

六、直观地高辛或生物素标记的 PRINS 产物

1.将含荧光素结合的抗地高辛抗体（或链霉亲和素 2ng/VL) 的 50|uL 封闭液加到标本上。盖上盖玻片避光孵育 30~60 min。

2.用 50 mL 的洗脱液洗脱 2 次，每次 5 min。这时的标本已经可以进行复染和封片。

七、复染及封片

1.用含0.4umol/L DAPI 的抗淬灭剂溶液可以获得蓝色复染的 DNA。

2.用含 PI 的抗淬灭剂溶液可以获得红色复染的 DNA，用 20ul 含 0.5ug/ml 的抗淬灭剂溶液将标本封片。