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DNA

构建复制缺陷型疱疹单纯病毒载体实验（基本方案2 构建有复制缺陷的载体）

2024-05-30 DNA 加入收藏

材料与仪器IE基因-补体细胞系胰蛋白酶 EDTA 完全的改良的eagle培养基插入带有报告暗盒的质粒限制性内切核酸酶病毒DNA 2 X HEPES 缓冲液

材料与仪器

IE基因-补体细胞系
胰蛋白酶 EDTA 完全的改良的eagle培养基插入带有报告暗盒的质粒限制性内切核酸酶病毒DNA 2 X HEPES 缓冲液 CaCl2 甘油 PBS 提取 DNA 的缓冲液 10 X PCR 扩增缓冲液 4dNTP 混合液 Taq DNA 聚合酶灭菌水
DNA 探针组织培养皿宽孔移液管细胞刮多渠道吸管操纵器和试剂储器 96孔培养平板

步骤

1•转染前3 天，分开培养IE基因用 I : 1〇胰蛋白酶/E D T A 培养补足型细胞系，使细胞在完全培养基中生长，培养2d。 2.转染前1 天，再一次用胰蛋白酶/E D T A 分开培养， 4 个 60m m 组织培养皿的每个都种 IXlO6细胞到3m l 完全培养基中，培养Id。 3•用报告暗盒线性化质粒，通过限制性内切核酸酶切掉H SV -I序列和在细菌载体上的任何存在的E. coZi DNA序列。 4. 用大孔的Tip，制备转染液，每个平皿加1〜 5jug的病毒D N A (转染后产生> 2 0 0 个噬菌斑)，相当于每个线性质粒D N A 对等 10〜5 0个病毒基因组D N A 。一个病毒 D N A 相当于 152kb。 5•加6 ( % l 2X H eB S 到每个管子，混勻冰上孵育20min，然后，逐滴加 41Ml 2mol/L CaCl2, 轻混匀，室温孵育20min。 6.吸去平皿中的培养基，每次一个平皿。用 lml 2X H e B S 清洗一次，吸尽，但在转染混合液添加前不能使平皿变干。 7•移液器反复吹打转染混合液打碎大的沉淀物，然后小心添加到单层生长的细胞上，一次一个平皿，孵育40m m 。 8. 每个平皿小心加入4m l 完全培养基M E M (含1 0 % FBS)，不要破坏转染混合物，孵育 4h。 9. 4h 孵育结束后，吸尽培养基及转染混合液。 lml 2X H e B S 清洗一次，不要破坏细胞的单层，吸尽。小心缓慢加入2ml 2 0 % 甘油，室温严格孵育4min。 10•小心吸尽甘油，用 2m l 完全培养基M E M (含1 0 % FBS) 清洗3 次，确保细胞单层不被破坏。 11•小心加人4m l 完全培养基M E M (含10%FBS)，孵育。每天显微观察两次，看病理效应的形成（C P E )， C P E 表明感染斑的形成。 C P E 产生时细胞呈圆形，多泡状。一般需要 3〜 5 天才能观察到 C P E ，依病毒及细胞类型不同而改变。 12•在噬菌斑破裂后（噬菌斑中央细胞死亡裂解），收集培养基暂时在4°C 保存。 1 3 .刮取细胞到Im l完全培养基MEM (含 1 0 % F B S ),转移到15ml离心管。 2000g ， 4°C 离心5min后， 250jul完全培养基MEM (含10% FB S)重悬。 14. 一80°C 及 3?°C 反复冻融三次裂解细胞释放病毒颗粒，用 cup-h o m 超声仪超声破碎细胞 5s， 2000g" ， 4°C 离心 5min。 15. 收集上清，与第12步收集的培养基混匀，一 80°C 保存备用，作为重组病毒母液。 16. 检测重组病毒母液的滴度（支持方案2)。 17.15ml离心管中加人3m l完全培养基MEM (含10% FBS)，含 IX lO 6IE 基因互补细胞，力[ UOpfu的重组病毒。蜡膜封口， 37°C摇床孵育lh。 18.感染完毕后，加入7m l 完全培养基M E M (含10% FBS)，并且转移到多孔板中储存池中，用多孔道移液器转移100^1到 96孔板的底部。孵育2〜5d，每天两次检测噬菌斑的形成，不要感染过度。

1 9 .挑取只感染单个噬菌斑的孔，转移其上清到新的96 孔板中，一80°C保存（病毒母液)。 20•用排枪将lOOplXgal染液覆盖培养板。 37°C 孵育过夜（某些情况下， 1〜2h 可观察到蓝斑）。 21.阳性对照置于另外两个孔进行限制分析（第 16〜20 步）以确保病毒株的纯度。 22. 最终纯化后，用病毒株生成midistock (支持方案1)。 2 3 . 将 5X IO5 耐药的IE 基因-补充（如 JC P27阳性）克隆种植于30mm组织培养皿中。培养过夜（次日皿将应从分汇合状态生长到汇合状态）。 2 4 . 抽取培养基并加人来自midistock制品的 IX lO 7Pfu病毒（第 2 2 步； M O I= IO )在 5 0 0 4 完全无血清培养基中。孵育 60〜90min，每隔 15min摇晃瓶子以确保接种物平均分布。 2 5 . 吸附反应后抽吸接种物，并加人2m l完全MEM/10%培养基，孵育 12〜16h。 2 6 . 抽吸培养基，用 Iml PBS pH7. 5 洗细胞。刮下细胞，转移至 1.5m l微型离心管。以最大超速室温离心3min沉淀细胞。 2 7 . 抽吸上清液。加入 20(^1 D N A 抽提缓冲液， 37°C孵育 1 〜 2 h 裂解细胞。煮细胞 15min0 28. 准备P C R 反应混合物（反应体系90jlJ): 10/^1 10XPCR 扩增缓冲液，含 15mmol/L MgCl2; 4jul 10mmol/L 4dNTP 混合物； 2jul lOOng/jul ICP27 或引物对； 2 4 lOU/pl T 叫 D N A 聚合酶； 72“ 无菌水。 29. 扩增反应后，加人 IOjlj J 煮沸的裂解产物再加含P C R 分析缓冲液ICP2 7 或引物对： 30个循环 Imin 95°C (变性） : Imin 60°C (退火） IOmin 71°C (延伸） 30. 以 JCP2 7 或 g B 特异性 D N A 为探针通过 Southern blot杂交分析 R T -P C R 反应产物。以材料列表中的引物扩增的JCP27或 g B 长度分别为219bp及 191bp。

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