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DNA

构建复制缺陷型疱疹单纯病毒载体实验（基本方案1 构建 HSV-1 IE基因补足型细胞系）

2024-05-30 DNA 加入收藏
材料与仪器Vero 细胞酶 EDTA 2 X HEPES 缓冲盐 CaCl2 甘油 新霉素盐溶液 冻存培养基 PBS DNA 浓缩缓冲液 10 X PCR 扩增


材料与仪器

Vero 细胞
酶 EDTA 2 X HEPES 缓冲盐 CaCl2 甘油 新霉素盐溶液 冻存培养基 PBS DNA 浓缩缓冲液 10 X PCR 扩增缓冲液 4dNTP 混合液 Taq DNA 聚合酶 结晶紫染液
完全 MEM 培养基 胶纯化质粒 DNA 片段 组织培养皿 组织培养瓶 冷冻离心机 细胞刮

步骤

1. 转染前3 天，用 1 : 10胰酶/E D T A 消化Vero细胞，培养2d。 2. 转染前一天，消化细胞1 : 2 传代到3〜5 个 60m m 培养皿中，控制细胞浓p 在 1〇6/皿，使用含10%胎牛血清的M E M 的完全培养基。培养ld。 — ^ 3•对每个皿的转染，先配制转染混合物： 2〜10吨胶纯化的质粒D N A ，用 2X 释到500^1，冰上孵育20m m 。准备转染试剂3 份。 ’ 6 怖 此 质 粒 必 须 包 含 有 H S V I E 基 因 启 动 子 调 控 的 I C P 2 7 编 码 序 列 。疮 參 广 主 ^ 室 可 能 提 供 这 质 粒 或 者 用 G e n B a n k 的 H S V I 序 列 克 隆 H S V 文 库 。各 药 ‘; S = $ 粒 可 以 商 业 购 买 到 （ 如 从 Clontech, Stratagene， U S B ) 。
4•将34^l2mol/LCaCl2 逐滴加人到转染混合物中，混匀后室温孵育20min。弃培养基 并 用 Iml 2X HePBS 洗一遍，小心不要让细胞完全干。 5•上下颠倒混匀转染混合物以破碎大块的沉淀物。小心将转染混合物加人到培养的细 胞中， 37°C孵 育 lOmin。 6. 每个培养皿中加入2.5m l完 全 培养基，培 养 6h。小 心 弃 培 养 基 （ 不要引起细胞漂 浮），再 用 Iml 2X H e PBS 洗一遍。 7•每个培养皿中小心加人2ml 20% 的丙三醇。室温孵育3h。 8. 小心弃掉丙三醇溶液，用 2m l 完全培养基洗3 遍。再小心加人3m l 完全培养基，培 养 24h。 9. 24h 后 ，弃培养基，再 加 入 3ml完全培养基，培 养 48h。 10. 48h 后 ，用 I.5ml 胰酶/EDTA 消化细胞，4°C ，IOOOg 离心 5min。 对于新霉素抗性克隆 Ila. 用 IOml含 I m g /m l 新霉素的完全培养基重悬细胞沉淀，按 4X 105 个细胞/皿接种 细胞。 12a. 孵育直至药物抗性的克隆出现，用加X !m g /m 丨新霉素的完全培养基每3c|换液。 筛选过程在第二到第三个星期内开始。克隆的出现不明显，生长迅速。 注意：不要从含新霉素的培养基中转移细胞 对嘌呤霉素抗性的克隆 lib. 用 3m l 含 1 0 % 胎牛血清的M E M 的完全培养基重悬沉淀物。接种细胞到1〇〇mm 细胞培养皿中。孵 育 2〜3d (2〜3 个分裂周期）直至细胞基本完全汇合。 12b. 用 3m l 完全培养基换液。孵育直至药物抗性的克隆出现，用 加 入 lmg/^ i嘌呤霉 素的完全培养基每3d 换液。用加人lmg/m l 嘌呤霉素的含1〇%胎牛血清的M E M 的完全培养基每3d 换液。 筛选过程从加入药物的24h 开始。 很少细胞可以在药物的 处 理 下存活，但这 些存活下来的细胞会不断复制并成为克隆的中心。 为减少假阳性克隆的出现，即使药物抗性的细胞 生 长 的缓慢， 也 要保持 10|ug/ml的嗓呤霉素农度。 在药物处理的情况下，嘌呤霉素抗性的克隆没有新霉素抗性的克隆长的好。 13. 克隆中心出现后，轻轻吸出培养基。一滴滴加入2 0 4 胰酶/EDTA到每个分离的克 隆中心，以保证它们较好的分离开。 14. 用200； /1的TIP头将培养皿上的克隆刮下，再将每个刮下的细胞克隆转移到装1〇ml 含 1 0 % 胎牛血清的M E M 的 15m l 离心管中。在将其按100jLxl /孔转移到圆底的％ 孔 组织培养板中。培养细胞以增殖克隆。 15. 扩大每个药物抗性的克隆（ 如 9 6 孔板中被药物抑制的细胞）到 25cm2 培养瓶中， 用加有适当药物的含1 0 % 胎牛血清的M E M 的完全培养基培养。当嘌呤霉素抗性的 克隆在25cm2 培养瓶中生长，将嘌呤霉素的浓度降到5〜7jug/m i 以加速克隆的 生长。 16. 用含有合适药物抗性的冻存液冻存细胞。一80°C冷冻后转移到液氮<中去。 17. 从药物抗性的细胞克隆中分5X 10°个细胞到3〇 mm组织培养皿中。培养过夜
18. 弃 培 养 基 并 用 P B S 洗 一 遍 。将 细 胞 从 培 养 皿 上 刮 下 来 再 转 到 L 5ml 离 心 管 中 ， 25°C高速离心3min聚集细胞。 19. 弃上清，加 入 200WDNA抽提缓冲液来裂解细胞。 37°C孵 育 l i l 2h (到无颗粒为 止）。将裂解液煮15min。 20. 制 备 ？ 0 ^ 反 应 混 合 物 （10〇4体系）： lOpl 10XPCR 扩 增 缓 冲 液 （ 含 15mmol/L MgCl2); 知1 10mmol/L dNTP 混合物； lOOng/pl ICP27 引 物 对 （200ng); 2pJ lOU/jul Tag DNA 聚合酶； 1〇4裂解液； 72jl J 无菌水。 21.用下面的扩增程序去扩增溶解产物 . 3 0 个循环： Imin 95°C (变性） Imin 60°C (退火） IOmin 60°C (延伸) 22•用琼脂糖凝胶电泳和用rcP 2 7 特 异 的 DNA探 针 进 行 Southern斑点杂交分析PCR 反应的产物。 用材料所指中特异的ICP2 7 基因的引物扩增了长为219b p 的产物。 23. 从 JCP27 阳性克隆中分I.5XlO6 个细胞接种到_ mrr^ 养皿中，加 5mi 完全培养 基 。 1 或 2 个皿用来进行突变检测。同 时 1〜2 个 皿 的 Vero细胞用来作为阴性对照。 培 养 24h。 24. IXlO3Pfu 的 HSV ICP2 7 突 变 病 毒 稀 释 到 5004 无 血 清 的 M EM 中。孵 育 60〜 90min， 每 15min 摇皿一次。 25. 贴壁后，弃病毒培养基，加 3ml 1 . 0 % 甲基纤维素覆盖。孵育直至斑点出现。一旦 斑点出现后，弃甲基纤维素。室 温 用 1 % 结晶紫染液染色5min。 26. 弃染液。用自来水轻轻洗皿除去剩余的染料。空气风干。确定补充的细胞系。 如 果 新 霉 素 或 者 嘌 呤 霉 素 抗 性 的 克 隆 可 以 补 充 基 因 产 物 （ICp4、 ICP27I或 者 CP0)，那么斑点就会出现在培养板中。对于含有两个h S V IE 基因融合的克隆， IE 基因中一个突变体的缺失可以在补偿细胞中生长。要求正基因突变体补偿细胞 系可以进行进一步分析以确定最好的补偿细胞。 27. 将 ICP2 7 阳性补充的细胞克隆中的L 5 X 106 个 细 胞 接 种 到 6〇〇 mm培养皿中，加 3ml完全培养基，培 养 2〜4h。 28. 5X 106 和 I Xl O7Pfu (MOI-二5 和 10) HSV I E 基 因 突 变 体 稀 释 到 500一 无血清 MEM 中。孵 育 60〜9Omin来吸附细胞，每 i5min 摇皿一次。 29•弃病毒接种体加入3ml 完全培养基，培 养 18〜24h。 30. 用细胞刮将细胞从培养板刮下来，转 移 到 i 5mi 离心管中。 31 . 准备储存液进行滴度测定（ 支 持 方 案 i ，第 4〜9 步）。将测滴度的病毒液稀释为3 个 浓 度 （ 支 持 方 案 2) 计算母个细胞产生的颗粒数来确定裂解量。补偿单个正基因突变的抗性克隆
有 不 同 的 裂 解 量 。 32.挑取病毒复制最快的克隆保存，一80°C 冷冻后转液氮。


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