核糖核酸酶保护(用核糖核酸酶和放射性标记的RNA探针对RNA作图)
原理核糖核酸酶保护分析用于度量特异性 mRNA 的丰度以及为它们的拓扑异构特征作图。这种方法包括测试 RNA 与互补的放射标记的 RNA 探针（核糖探针）杂交，
原理
核糖核酸酶保护分析用于度量特异性 mRNA 的丰度以及为它们的拓扑异构特征作图。这种方法包括测试 RNA 与互补的放射标记的 RNA 探针（核糖探针）杂交，然后未杂交的序列被一种或几种单链特异性的核糖核酸酶裂解。
材料与仪器
RNA 聚合酶 DNase I 蛋白酶 K RNA 酶抑制剂 RNA 酶消化混合液 载体 RNA 核糖核苷酸 标准 RNA 待测 RNA UTP 核糖核酸探针
乙酸铵 DTT 杂交缓冲液 苯酚 氯仿 RNA 凝胶加样缓冲液 SDS 乙酸钠 TE 转录缓冲液 三氯乙酸 聚合酶稀释缓冲液
变性的聚丙烯酰胺凝胶 水浴 Whatman 3 MM 滤纸或类似物
乙酸铵 DTT 杂交缓冲液 苯酚 氯仿 RNA 凝胶加样缓冲液 SDS 乙酸钠 TE 转录缓冲液 三氯乙酸 聚合酶稀释缓冲液
变性的聚丙烯酰胺凝胶 水浴 Whatman 3 MM 滤纸或类似物
步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
乙酸铵（10 mol/L）
DTT ( 0.2 mol/L)
杂交缓冲液（用于 RNA)（40 mmol/L PIPES (pH 6.8)，1 mmol/L EDTA ( pH 8.0)，0.4 mol/L NaCl，80% 去离子甲酰胺，使用 PIPES 的二钠盐，用 1 mol/L 的盐酸调节 pH。）
苯酚：氯仿（1:1，V/V）
RNA 凝胶加样缓冲液（95% 去离子甲酰胺，0.025% （m/V）溴酚蓝，0.025% （m/V）二甲苯腈蓝 FF，5 mmol/L EDTA（pH 8.0），0.025% （m/V）SDS）
SDS ( 10% m/V)
乙酸钠（3 mol/L，pH 5.2)
TE ( pH 7.6)
10X 转录缓冲液（0.4 mol/L Tris-Cl( pH 7.5 )，0.1 mol/L NaCl，60 mmol/L MgCI2，20 mmol/L 亚精胺，-20℃ 分装保存）
三氯乙酸（1% 和 10% TCA)
2. 酶和缓冲液
噬菌体编码的依赖 DNA 的 RNA 聚合酶
DNase I ( 1 mg/ml，无 RNase 的胰 DNase)
聚合酶稀释缓冲液
蛋白酶 K ( 10 mg/ml)
RNA 酶抑制剂，置冰上
RNA 酶消化混合液（300 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.4)，5 mmol/L EDTA（pH 7.5)，40 μg/ml RNase A，2 μg/ml RNase T1，用 10 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.5 )，15 mmol/L NaCl 制备 10 mg/ml RNase A (小牛胰 RNaae)，用 10 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.5 )，15 mmol/L NaCl 制备 1 mg/ml RNase T1，凝胶）
变性的聚丙烯酰胺凝胶（含 8 mol/L 尿素）
3. 核酸和寡核苷酸
载体 RNA (1 mg/ml）
用于模板制备的质粒 DNA 或线性靶 DNA
核糖核苷酸
标准 RNA
待测 RNA
UTP (100 μmol/L)
4. 探针
核糖核酸探针
5. 放射活性成分
[α-32P] UTP（10 mCi/ml，800 Ci/mmol）
6. 专用设备
预置到 30℃，85℃，95℃ 和合适复性温度的水浴
Whatman 3 MM 滤纸或类似物
二、方法
制备随机标记的单链 RNA 探针
1. 制备线性 DNA 模板
(1) 从质粒 DNA 制备模板
① 用 5 倍过量的适当的限制性内切核酸酶切割克隆的 DNA 序列内部或下游使 5~20 μg 质粒线性化。线性化后形成的末端与启动子距离应为 200~400 bp。确保所使用的限制酶不直接使启动子与目的序列分离。因为噬菌体编码的 RNA 聚合酶需 3' 末端起始转录，所以选择能产生平末端或 5' 突出端的限制酶。
② 消化反应后，取少量反应液用琼脂糖凝胶电泳分析。确保无痕量的环状质粒可见，否则，加入适量的酶继续消化直到检测不到环状质粒为止。
③ 酚：氯仿抽提两次纯化线形 DNA，再利用乙醇沉淀。沉淀用 70% 乙醇洗涤，pH7.6 的 TE 溶液溶解，浓度为 1 μg/μl。
(2) 靶 DNA 扩增制备模板
① 用 PCR 扩增长度为 100~400 bp 的双链 DNA 模板（Schowalter and Sommer 1989; Bales et al.1993; Davis et al. 1997)。
② 琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 PCR 扩增产物以确保片段大小正确。
③ 酚：氯仿抽提两次纯化线形 DNA，再利用乙醇沉淀。沉淀用 70% 乙醇洗涤， pH 7.6 的 TE 溶液溶解，浓度为 1 μg/μl。
2. 按顺序混合下列溶液，除特殊说明的预热至室温。
0.5 μg 线性的 DNA 模板
1 μl 0.2 mol/L DTT
2 μl 核酸溶液
1 μl 100 μmol/L UTP
50~100 μCi [α-32P] UTP（10 mCi/ml，800 Ci/mmol）
补水至 16 μl
2 μl 10X 转录缓冲液
24 单位 RNA 酶抑制剂（冰上）
15~20 单位噬菌体 RNA 聚合酶（冰上）
室温下按顺序加入上述试剂既可防止 DNA 被转录缓冲液中的亚精胺和 Mg2+ 沉淀，又可防止 RNA 酶抑制剂被高浓度的 DTT 失活。
将上述混合液 37℃ 保温 60 min。
3. 上述反应结束时，加入 1 单位不含 RNA 酶的 DNA 酶约 1 μg，继续 37℃ 保温 10 min。
4. 用 TE 缓冲液（pH 7.6) 稀释反应液至 100 μl，取 1 μl 测量总放射活性和可被 TCA 沉淀的放射活性。通过掺入的可被 TCA 沉淀物质的放射活性比例，计算反应合成的 RNA 探针重量和特异性活性。
5. 第 4 步溶液移取 1 μl 后，在剩余稀释反应液中加入 10 μl 1 mg/ml 载体 RNA。酚: 氯仿抽提反应液，将水相移至一新管，加入 10 μl 10 mol/L 乙酸铵 300 μl 乙醇沉淀 RNA。贮存于 -20℃ 直到第 4 步完成。
6. 4℃ 高速离心 10 min 回收 RNA。75% 乙醇洗涤，再次离心。弃上清，室温干燥 RNA 直到无痕量乙醇可见。若探针需凝胶电泳进一步纯化（步骤7），则用 20 μl 胶加样缓冲液稀释沉淀的 RNA，否则，用 20 μl TE 缓冲液（pH 7.6 ) 稀释沉淀的 RNA。
7. 用预先准备的含有 8 mol/L 尿素的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化探针。高特异性活性的探针应在近期使用，以避免 RNA 的放射化学损伤。
8. 将待测的每种 RNA 和标准 RNA 核酸探针合并（2X105~10X105 cpm，0.1~0.5 ng) 。加入 0.1 倍体积 3 mol/L 乙酸钠 (pH 5.2）和 2.5 倍体积冰乙醇。将混合物贮存于 -20℃ 10 min，4℃ 高速离心 10 min 回收 RNA。75% 乙醇洗涤沉淀。小心弃去乙醇，室温干燥沉淀直到乙醇完全蒸发。
9. 用 30 μl 杂交缓冲液溶解 RNA。多次上下吹打溶液以保证沉淀彻底溶解。
10. 杂交混合液在 85℃ 保温 10 min 使 RNA 变性，然后迅速将其转移至设置在复性温度的保温器后或水浴中，保温 8~12 h。
11. 将杂交混合液冷却到室温，加入 300 μl RNA 酶消化混和液，30℃ 消化 60 min。
12. 加入 20 μl 10% SDS 和 10 μl 10 mg/ml 蛋白酶 K 终止反应。反应混合液 37℃ 保温 30 min。
13. 加入 400 μl 酚: 氯仿，剧烈震荡 30 s, 室温离心 5 min 分相。
14. 将上相移至新管，小心避免接触两相中间界面。
15. 加入 20 μg 载体 RNA 和 750 μl 冰乙醇。将溶液混合并 -20℃ 放置 30 min。
16. 4℃ 高速离心 15 min 回收 RNA。小心弃去乙醇，用 500 μl 170% 乙醇洗涤沉淀。再次离心。
17. 小心弃去乙醇，室温干燥直到痕量乙醇蒸发。
凝胶电泳分析抗 RNA 酶的杂交体
18. 用 10 μl 凝胶加样缓冲液重悬沉淀。
19. 95℃ 加热核酸 5 min，迅速置冰上。短暂离心使样品收集在管底。
20. 利用含 8 moI/L 尿素的聚丙烯酰胺薄胶电泳分析标记的核酸。
21. 当示踪染料在胶中迁移至合适距离后，关掉电源，拆除电泳装置。轻轻撬开大玻璃板一角，慢慢从胶上移开大玻璃板。切掉胶的一角以辨别方向。
22. 将带有胶的玻璃板移到装有过量的 10% TCA 的托盘中。轻轻在室温下摇动或旋转托盘 10 min。
23. 倒掉 10% TCA 溶液并代之以过量的 1% TCA。轻轻在室温下摇动或旋转托盘 5 min。
24. 倒掉 1% TCA 溶液，用蒸馏的去离子水淋洗固定过的胶。将玻璃板连同胶从托盘中取出放于平板上。用纸从胶边缘吸走多余的水分。
25. 割取一张比胶边缘大 1 cm 的 30 MM 滤纸，将其置于胶上，将玻璃板倒转。
26. 拿开玻璃板，将胶放到凝胶干燥器中 60℃ 干燥 1~1.5 h。
27. 建立胶的自显影影像。通过密度计量学或磷光摄影扫描，也可以切下胶中含有相应片段的部分，利用液闪仪计数。
1. 缓冲液和溶液
乙酸铵（10 mol/L）
DTT ( 0.2 mol/L)
杂交缓冲液（用于 RNA)（40 mmol/L PIPES (pH 6.8)，1 mmol/L EDTA ( pH 8.0)，0.4 mol/L NaCl，80% 去离子甲酰胺，使用 PIPES 的二钠盐，用 1 mol/L 的盐酸调节 pH。）
苯酚：氯仿（1:1，V/V）
RNA 凝胶加样缓冲液（95% 去离子甲酰胺，0.025% （m/V）溴酚蓝，0.025% （m/V）二甲苯腈蓝 FF，5 mmol/L EDTA（pH 8.0），0.025% （m/V）SDS）
SDS ( 10% m/V)
乙酸钠（3 mol/L，pH 5.2)
TE ( pH 7.6)
10X 转录缓冲液（0.4 mol/L Tris-Cl( pH 7.5 )，0.1 mol/L NaCl，60 mmol/L MgCI2，20 mmol/L 亚精胺，-20℃ 分装保存）
三氯乙酸（1% 和 10% TCA)
2. 酶和缓冲液
噬菌体编码的依赖 DNA 的 RNA 聚合酶
DNase I ( 1 mg/ml，无 RNase 的胰 DNase)
聚合酶稀释缓冲液
蛋白酶 K ( 10 mg/ml)
RNA 酶抑制剂，置冰上
RNA 酶消化混合液（300 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.4)，5 mmol/L EDTA（pH 7.5)，40 μg/ml RNase A，2 μg/ml RNase T1，用 10 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.5 )，15 mmol/L NaCl 制备 10 mg/ml RNase A (小牛胰 RNaae)，用 10 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.5 )，15 mmol/L NaCl 制备 1 mg/ml RNase T1，凝胶）
变性的聚丙烯酰胺凝胶（含 8 mol/L 尿素）
3. 核酸和寡核苷酸
载体 RNA (1 mg/ml）
用于模板制备的质粒 DNA 或线性靶 DNA
核糖核苷酸
标准 RNA
待测 RNA
UTP (100 μmol/L)
4. 探针
核糖核酸探针
5. 放射活性成分
[α-32P] UTP（10 mCi/ml，800 Ci/mmol）
6. 专用设备
预置到 30℃，85℃，95℃ 和合适复性温度的水浴
Whatman 3 MM 滤纸或类似物
二、方法
制备随机标记的单链 RNA 探针
1. 制备线性 DNA 模板
(1) 从质粒 DNA 制备模板
① 用 5 倍过量的适当的限制性内切核酸酶切割克隆的 DNA 序列内部或下游使 5~20 μg 质粒线性化。线性化后形成的末端与启动子距离应为 200~400 bp。确保所使用的限制酶不直接使启动子与目的序列分离。因为噬菌体编码的 RNA 聚合酶需 3' 末端起始转录，所以选择能产生平末端或 5' 突出端的限制酶。
② 消化反应后，取少量反应液用琼脂糖凝胶电泳分析。确保无痕量的环状质粒可见，否则，加入适量的酶继续消化直到检测不到环状质粒为止。
③ 酚：氯仿抽提两次纯化线形 DNA，再利用乙醇沉淀。沉淀用 70% 乙醇洗涤，pH7.6 的 TE 溶液溶解，浓度为 1 μg/μl。
(2) 靶 DNA 扩增制备模板
① 用 PCR 扩增长度为 100~400 bp 的双链 DNA 模板（Schowalter and Sommer 1989; Bales et al.1993; Davis et al. 1997)。
② 琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 PCR 扩增产物以确保片段大小正确。
③ 酚：氯仿抽提两次纯化线形 DNA，再利用乙醇沉淀。沉淀用 70% 乙醇洗涤， pH 7.6 的 TE 溶液溶解，浓度为 1 μg/μl。
2. 按顺序混合下列溶液，除特殊说明的预热至室温。
0.5 μg 线性的 DNA 模板
1 μl 0.2 mol/L DTT
2 μl 核酸溶液
1 μl 100 μmol/L UTP
50~100 μCi [α-32P] UTP（10 mCi/ml，800 Ci/mmol）
补水至 16 μl
2 μl 10X 转录缓冲液
24 单位 RNA 酶抑制剂（冰上）
15~20 单位噬菌体 RNA 聚合酶（冰上）
室温下按顺序加入上述试剂既可防止 DNA 被转录缓冲液中的亚精胺和 Mg2+ 沉淀，又可防止 RNA 酶抑制剂被高浓度的 DTT 失活。
将上述混合液 37℃ 保温 60 min。
3. 上述反应结束时，加入 1 单位不含 RNA 酶的 DNA 酶约 1 μg，继续 37℃ 保温 10 min。
4. 用 TE 缓冲液（pH 7.6) 稀释反应液至 100 μl，取 1 μl 测量总放射活性和可被 TCA 沉淀的放射活性。通过掺入的可被 TCA 沉淀物质的放射活性比例，计算反应合成的 RNA 探针重量和特异性活性。
5. 第 4 步溶液移取 1 μl 后，在剩余稀释反应液中加入 10 μl 1 mg/ml 载体 RNA。酚: 氯仿抽提反应液，将水相移至一新管，加入 10 μl 10 mol/L 乙酸铵 300 μl 乙醇沉淀 RNA。贮存于 -20℃ 直到第 4 步完成。
6. 4℃ 高速离心 10 min 回收 RNA。75% 乙醇洗涤，再次离心。弃上清，室温干燥 RNA 直到无痕量乙醇可见。若探针需凝胶电泳进一步纯化（步骤7），则用 20 μl 胶加样缓冲液稀释沉淀的 RNA，否则，用 20 μl TE 缓冲液（pH 7.6 ) 稀释沉淀的 RNA。
7. 用预先准备的含有 8 mol/L 尿素的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化探针。高特异性活性的探针应在近期使用，以避免 RNA 的放射化学损伤。
8. 将待测的每种 RNA 和标准 RNA 核酸探针合并（2X105~10X105 cpm，0.1~0.5 ng) 。加入 0.1 倍体积 3 mol/L 乙酸钠 (pH 5.2）和 2.5 倍体积冰乙醇。将混合物贮存于 -20℃ 10 min，4℃ 高速离心 10 min 回收 RNA。75% 乙醇洗涤沉淀。小心弃去乙醇，室温干燥沉淀直到乙醇完全蒸发。
9. 用 30 μl 杂交缓冲液溶解 RNA。多次上下吹打溶液以保证沉淀彻底溶解。
10. 杂交混合液在 85℃ 保温 10 min 使 RNA 变性，然后迅速将其转移至设置在复性温度的保温器后或水浴中，保温 8~12 h。
11. 将杂交混合液冷却到室温，加入 300 μl RNA 酶消化混和液，30℃ 消化 60 min。
12. 加入 20 μl 10% SDS 和 10 μl 10 mg/ml 蛋白酶 K 终止反应。反应混合液 37℃ 保温 30 min。
13. 加入 400 μl 酚: 氯仿，剧烈震荡 30 s, 室温离心 5 min 分相。
14. 将上相移至新管，小心避免接触两相中间界面。
15. 加入 20 μg 载体 RNA 和 750 μl 冰乙醇。将溶液混合并 -20℃ 放置 30 min。
16. 4℃ 高速离心 15 min 回收 RNA。小心弃去乙醇，用 500 μl 170% 乙醇洗涤沉淀。再次离心。
17. 小心弃去乙醇，室温干燥直到痕量乙醇蒸发。
凝胶电泳分析抗 RNA 酶的杂交体
18. 用 10 μl 凝胶加样缓冲液重悬沉淀。
19. 95℃ 加热核酸 5 min，迅速置冰上。短暂离心使样品收集在管底。
20. 利用含 8 moI/L 尿素的聚丙烯酰胺薄胶电泳分析标记的核酸。
21. 当示踪染料在胶中迁移至合适距离后，关掉电源，拆除电泳装置。轻轻撬开大玻璃板一角，慢慢从胶上移开大玻璃板。切掉胶的一角以辨别方向。
22. 将带有胶的玻璃板移到装有过量的 10% TCA 的托盘中。轻轻在室温下摇动或旋转托盘 10 min。
23. 倒掉 10% TCA 溶液并代之以过量的 1% TCA。轻轻在室温下摇动或旋转托盘 5 min。
24. 倒掉 1% TCA 溶液，用蒸馏的去离子水淋洗固定过的胶。将玻璃板连同胶从托盘中取出放于平板上。用纸从胶边缘吸走多余的水分。
25. 割取一张比胶边缘大 1 cm 的 30 MM 滤纸，将其置于胶上，将玻璃板倒转。
26. 拿开玻璃板，将胶放到凝胶干燥器中 60℃ 干燥 1~1.5 h。
27. 建立胶的自显影影像。通过密度计量学或磷光摄影扫描，也可以切下胶中含有相应片段的部分，利用液闪仪计数。
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