批量层析方法筛选 poly (A)+ RNA
原理当处理许多 RNA 样品或处理小量的哺乳动物总 RNA 时（<50 μg)，可选择用 oligo (dT) —纤维素进行批量层析的方法。这种方法采用级
原理
当处理许多 RNA 样品或处理小量的哺乳动物总 RNA 时（<50 μg)，可选择用 oligo (dT) —纤维素进行批量层析的方法。这种方法采用级别较好的 oligo (dT) —纤维素，在最佳温度进行结合和洗涤。多年来发表了许多纯化 poly (A)+ RNA 的批量层析方法。
材料与仪器
总 RNA
吸附 洗涤缓冲液 醋酸铵 乙醇 冰预冷的水 NaCl TES
比色杯 微量离心机 Oligo (dT)18-30—纤维素 旋转轮 水浴
吸附 洗涤缓冲液 醋酸铵 乙醇 冰预冷的水 NaCl TES
比色杯 微量离心机 Oligo (dT)18-30—纤维素 旋转轮 水浴
步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
吸附/洗涤缓冲液（含 0.5 mol/L NaCl 的 TES 缓冲液）
醋酸铵（10 mol/L）
乙醇
冰预冷的水
NaCl（5 mol/L）
TES
2. 核酸和寡核苷酸
总 RNA
3. 专用设备
用于测量 260 nm 吸光值的比色杯
有速度控制的微量离心机
Oligo (dT)18-30—纤维素
旋转轮
55℃ 和 65℃ 的水浴
二、方法
1. 在一系列灭菌微量离心管中，将每份总 RNA ( 上限为 1 mg ) 样品的体积用 TES 调整到 600 μl。封好管口，在 65℃ 加热 10 min，然后迅速在冰上冷却到 0℃ 。每份样品加 75 μl ( 0.1 倍体积）5 mol/L NaCl。
2. 在每管中加 50 mg ( 500 μl) 平衡的 oligo (dT)—纤维素，盖好管盖，室温下在旋转轮上温育 15 min。
3. 用微量离心机在室温下离心，600~800 g ( 约 1500~2500 r/min)，2 min。
4. 将上清移到一系列干净的离心管中，置冰上存放。
5. 在含 oligo (dT) 的沉淀中加 1 ml 冰预冷的吸附/洗涤缓冲液。温和旋涡震荡分散沉淀。将盖好盖子的离心管置于旋转轮上，室温下温育 2 min。
6. 室温下，用微量离心机离心，600~800 g ( 约 1500~2500 r/min), 2 min。弃上清。 重复步骤 5 和 6 两次。
7. 在含 oligo(dT) 的沉淀中加 0.4 ml 冰预冷的双蒸灭菌水，温和旋涡震荡以重悬沉淀。立即在微离心机上离心，4℃，2 min。
8. 小心吸去上清。
9. 回收结合的 poly(A)+ RNA：用 400 μl 双蒸灭菌水重悬沉淀，在 55℃ 温育 5 min，然后 4℃ 离心 2 min。
10. 将上清移至一系列干净的离心管中，重复步骤 9 两次，合并所有上清。
11. 在上清中加 0.2 倍体积的 10 mol/L 醋酸铵和 2.5 倍体积的乙醇，在 -20℃ 存放 30 min。
12. 回收沉淀的 poly (A)+ RNA： 4℃ 离心，最大速度，15 min。小心弃上清，用 70% 乙醇洗沉淀，短暂离心，吸去上清，将管盖打开，倒置数分钟，使大部分残留的乙醇挥发。
13. 用小体积灭菌的 DEPC 处理的水溶解 RNA。
14. 估计 RNA 浓度。
15. 保存样品。
1. 缓冲液和溶液
吸附/洗涤缓冲液（含 0.5 mol/L NaCl 的 TES 缓冲液）
醋酸铵（10 mol/L）
乙醇
冰预冷的水
NaCl（5 mol/L）
TES
2. 核酸和寡核苷酸
总 RNA
3. 专用设备
用于测量 260 nm 吸光值的比色杯
有速度控制的微量离心机
Oligo (dT)18-30—纤维素
旋转轮
55℃ 和 65℃ 的水浴
二、方法
1. 在一系列灭菌微量离心管中，将每份总 RNA ( 上限为 1 mg ) 样品的体积用 TES 调整到 600 μl。封好管口，在 65℃ 加热 10 min，然后迅速在冰上冷却到 0℃ 。每份样品加 75 μl ( 0.1 倍体积）5 mol/L NaCl。
2. 在每管中加 50 mg ( 500 μl) 平衡的 oligo (dT)—纤维素，盖好管盖，室温下在旋转轮上温育 15 min。
3. 用微量离心机在室温下离心，600~800 g ( 约 1500~2500 r/min)，2 min。
4. 将上清移到一系列干净的离心管中，置冰上存放。
5. 在含 oligo (dT) 的沉淀中加 1 ml 冰预冷的吸附/洗涤缓冲液。温和旋涡震荡分散沉淀。将盖好盖子的离心管置于旋转轮上，室温下温育 2 min。
6. 室温下，用微量离心机离心，600~800 g ( 约 1500~2500 r/min), 2 min。弃上清。 重复步骤 5 和 6 两次。
7. 在含 oligo(dT) 的沉淀中加 0.4 ml 冰预冷的双蒸灭菌水，温和旋涡震荡以重悬沉淀。立即在微离心机上离心，4℃，2 min。
8. 小心吸去上清。
9. 回收结合的 poly(A)+ RNA：用 400 μl 双蒸灭菌水重悬沉淀，在 55℃ 温育 5 min，然后 4℃ 离心 2 min。
10. 将上清移至一系列干净的离心管中，重复步骤 9 两次，合并所有上清。
11. 在上清中加 0.2 倍体积的 10 mol/L 醋酸铵和 2.5 倍体积的乙醇，在 -20℃ 存放 30 min。
12. 回收沉淀的 poly (A)+ RNA： 4℃ 离心，最大速度，15 min。小心弃上清，用 70% 乙醇洗沉淀，短暂离心，吸去上清，将管盖打开，倒置数分钟，使大部分残留的乙醇挥发。
13. 用小体积灭菌的 DEPC 处理的水溶解 RNA。
14. 估计 RNA 浓度。
15. 保存样品。
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