哺乳动物 DNA 的快速分离

根据本方案制备的哺乳动物 DNA 约 20~50 kb，适于作 PCR 反应的模板。DNA 产量在 0.5 到 3.0 μg/mg 组织之间变化，或者是 5~15 μg/300μl 全血。

无 DNase 的 RNase 蛋白酶 K 哺乳动物组织或全血
细胞裂解缓冲液 乙醇 异丙醇 醋酸钾溶液 红细胞裂解缓冲液 TE
连有真空管的抽吸装置 微量离心研棒 水浴

一、材料

1. 缓冲液及溶液

细胞裂解缓冲液（10 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)，1 mmol/L EDTA ( pH 8.0)，0.1%（m/V） SDS）

乙醇

异丙醇

醋酸钾溶液（60 ml 的 5 mol/L 醋酸钾，11.5 ml 冰醋酸，28.5 ml 水）

红细胞裂解缓冲液（20 mmol/L Tris-Cl (pH 7.6)

TE ( pH 7.6)

2. 酶及缓冲液

无 DNase 的 RNase ( 4 mg/ml)

蛋白酶 K ( 20 mg/ml)

3. 专用设备

连有真空管的抽吸装置

微量离心研棒

预先调到 55℃ 或 65℃ 的水浴

4. 细胞和组织

哺乳动物组织或全血

二、方法

1. 准备用于分离 DNA 的组织或全血

(1) 组织

① 切下 10~20 mg 组织。

② 用剃刀或解剖刀切碎组织或者将组织冷冻于液氮中，用在液氮中预冷的研钵研磨成粉。

(2) 血液

① 在两个微量离心管中分别转移 300 μl 全血样品。每管中加入 900 μl 红细胞裂解缓冲液，盖上盖子，颠倒混匀。溶液于室温下放置 10 min, 中间颠倒混匀几次。

② 室温下用最大转速离心 20 s。

③ 每管保留 20 μl 上清，弃去其他部分。

④ 用剩余的少量上清重悬白细胞沉淀。将两管中的沉淀合成一管。

2. 将切碎的组织或者重悬的白细胞沉淀转移到加有 600 μl 冰冷的细胞裂解缓冲液的离心管中。用微量研棒迅速研磨 30~50 下，混匀悬浊液。

3. (可选择的）向裂解产物中加入 3 μl 蛋白酶 K, 以增加基因组 DNA 的产量。消化液置于 55℃ 放置 3 h 以上，但不要超过 16 h。

4. 消化液降至室温，然后加入 3 μl 4 mg/ml 的无 DNase 的 RNase。37℃ 放置 15~60 min。

5. 将样品降至室温。加入 200 μl 醋酸钾溶液，剧烈振荡 20s 使其充分混合。

6. 用最高转速 4℃ 离心 3 min, 使蛋白/SDS 复合物沉淀出来。

7. 将上清转移到加有 600 μl 异丙醇的新离心管中。充分混合，然后用最大转速室温下离心 1 min 收集 DNA 沉淀。

8. 吸去上清，加入 600 μl 70% 的乙醇。颠倒管子数次，用最大转速室温下离心 1 min。

9. 小心吸去上情，空气中干燥 DNA 沉淀 15 min。

10. 将 DNA 沉淀溶解于 100 μl TE ( pH 7.6)。