直链淀粉树脂亲和层析纯化麦芽糖结合融合蛋白实验
材料与仪器表达 BMP 融合蛋白的大肠杆菌细胞细胞裂解缓冲液 细胞洗涤缓冲液 柱洗脱缓冲液 柱洗涤缓冲液 MgCl2 PMSF SDS 凝胶加样缓冲液 Tris
材料与仪器
表达 BMP 融合蛋白的大肠杆菌细胞
细胞裂解缓冲液 细胞洗涤缓冲液 柱洗脱缓冲液 柱洗涤缓冲液 MgCl2 PMSF SDS 凝胶加样缓冲液 Tris-Cl DNase 溶菌酶 RNase凝血酶、肠激酶或 Xa 因子溶液 SDS-聚丙烯酰胺凝胶
Beckman Ti60 转头或相当的转头 Sorvall GSA 转头或相当的转头 Sorvall SS-34 转头或相当的转头 直链淀粉琼脂糖 沸水浴 超声仪器 —次性 Nalgene 滤器
细胞裂解缓冲液 细胞洗涤缓冲液 柱洗脱缓冲液 柱洗涤缓冲液 MgCl2 PMSF SDS 凝胶加样缓冲液 Tris-Cl DNase 溶菌酶 RNase凝血酶、肠激酶或 Xa 因子溶液 SDS-聚丙烯酰胺凝胶
Beckman Ti60 转头或相当的转头 Sorvall GSA 转头或相当的转头 Sorvall SS-34 转头或相当的转头 直链淀粉琼脂糖 沸水浴 超声仪器 —次性 Nalgene 滤器
步骤
材料
缓冲液和溶液
贮存液、缓冲液和试剂的成分参见附录1。
贮存液稀释至适当浓度。
细胞裂解缓冲液（~150 ml)
30 mmol/LTris-Cl(pH7.l)
0.1 mmol/LEDTA
20%(m/V)蔗糖
细胞洗涤缓冲液（~250 ml)
10 mmol/LTris-Cl(pH7.1)
30 mmol/LNaCl
柱洗脱缓冲液（~100 ml)
10 mmol/LTris-Cl(pH7.5)
10 mmol/L麦芽糖
柱洗涤缓冲液（~250 ml)
10 mmol/L Tris-Cl(pH7.1)
1mol/L NaCl
MgCl2(0.1 mmol/L,~250 ml)
PMSF(100mmol/L)
17.4 mgPMSF溶于1 ml异丙醇，-20°C贮存。
PMSF在水洧液中易失活，失活速率随水溶液pH值的升高而升高，而且在25°C比在4°C失活快。20mmol/LpH8.0的PMSF 水溶液的半衰期是35 min左右（James1978), 这么短的半衰期意味着碱性(pH>8.6)PMSF水溶液在室溫贮存数小时后可以安全丢弃。
可向 Boehringer Mannheim 公司购买 PMSF 替代品（4-[2-氨基乙基]-苯磺酰氟, 盐酸盐；Pefabloc SC),Pefabloc 是不可逆丝氨酸蛋白酶抑制剂，使用浓度与 PMSF 相同，但无毒性，而且在水溶液中稳定。
1XSDS 凝胶加样缓冲液
不含 DTT 的 1xSDS 凝胶加样缓冲液室溫保存，1mol/LDTT 贮存液现用现加于上述缓冲液。
Tris-Cl(10 mmol/L,pH7.1)
酶和缓冲液
DNase(5 mg/ml)
溶菌酶
RNase(5 mg/ml)
凝血酶、肠激酶或 Xa 因子溶液
溶液的配制和贮存参照生产商手册。
凝胶
SDS-聚丙烯酰胺凝胶（10%)
用于分离蛋白的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备参考附录 8。
离心机和转头
Beckman Ti60 转头或相当的转头
Sorvall GSA 转头或相当的转头
Sorvall SS-34 转头或相当的转头
特别配备
直链淀粉琼脂糖
可以参照 Kdlermann 和 Ferenci(1982) 的方法合成，也可以向 New England Bioland 公 SJ 购买（每毫升柱床体积结合 1~4 mg MBP）。
沸水浴
超声仪器
参见附录 8。
—次性 Nalgene 滤器（0.45um 硝酸纤维素膜）
载体和细菌菌株
表达 BMP 融合蛋白的大肠杆菌细胞（方案 1 或 2 的步骤 17 所制备的细胞沉淀)。
方法
直链淀粉琼脂糖柱的准备
1.4°C 悬于 10 mmol/LTris-Cl(pH7.1) 的直链淀粉琼脂糖装 3 cmX6 cm 柱。
制备细胞抽提物
2. 细胞沉淀悬于相当于原培养物 1/10 体积（一般为 50 ml) 的冰冷的细胞洗涤缓冲液,4°C 5000 g(5500r/min Sovall GSA 转头）离心 15 min 收集细胞沉淀，再悬于相当于原培养物 1/10 体积（一般为 50 ml) 的冰冷的细抱洗涤缓冲液。
3. 制备细胞裂解物
如果所用载体不带 MBP 信号肽序列（pMAL-c2)
a. 超声破碎细胞, 功率 30W, 保持细胞低温（0°C)。
b. 为使溶液澄清，加入 PMSF 至终浓度 1 mmol/L, 于 4°C 以 87000 g(35000r/min Beckman Ti60转头）离心 30 min。
继续步骤 4, 直链淀粉琼脂糖层析从上清中纯化融合蛋白。
如果所用载体带有 MBP 言号肽序列（pMAL-p2)
a.4°C5000 g(5500r/min Sorvall GSA 转头）离心 15 min 收集细胞，沉淀悬于相当于原培养物 1/20 体积（一般为 25 ml) 的冰冷的细胞裂解缓冲液。
b. 加入 PMSF 至终浓度 1 mmol/L，室温搅动 15 min, 于 4°C 以 17200 g(12000r/min Sorvall SS-34 转头）离心 10 min 收集细胞。
c. 旋动细胞沉淀，加入冰冷的 0.1 mmol/LMgCl2 溶液（每升培养物加 lOOml),4°C 揽动 10 min。
d. 休克细胞 4°C17200 g(12000r/min Sorvan SS-34 转头）离心 10 min, 在上清中加入 lOmmol/L Tris-Cl(pH7.1) 至 pH 达到 7.1。
e. 上清用 100 ml—次性 Nalgene 滤器（0.45um 硝酸纤维素膜）过滤，滤液用 100 倍体积的 10 mmol/LTris-Cl(pH7.1)4°C 透析。继续步骤 4, 直链淀粉琼脂糖层析从上清中纯化融合蛋白。
纯化融合蛋白
4. 步骤 3 获得的上清上柱，100 ml10 mmol/LTris-Cl(pH7.1) 漂洗，100 ml 柱洗涤缓冲液冲洗。
5. 用 50 ml 柱洗脱缓冲液洗脱结合的融合蛋白，每份 1 ml 分步收集。
6.SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析融合蛋白的分布，合并含融合蛋白的样品并贮存于-70°C。
7. 用适当的蛋白酶切割融合蛋白释放靶蛋白。
a. 加入凝血酶、肠激酶或 Xa 因子（根据融合蛋白中的位点选择)。每毫升树脂加入 50 单位的溶于 lmlPBS 的蛋白酶。颠倒离心管数次混勻，室温下振荡 2~16 h。用小规模试验确定获得最高产量所需时间。
b.4°C 以 500 g(2100r/min Sorvall SS-34 转头）离心 5 min, 上清小心转移到新管中。
用传统的层析方法或 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离靶蛋白和蛋白酶。
缓冲液和溶液
贮存液、缓冲液和试剂的成分参见附录1。
贮存液稀释至适当浓度。
细胞裂解缓冲液（~150 ml)
30 mmol/LTris-Cl(pH7.l)
0.1 mmol/LEDTA
20%(m/V)蔗糖
细胞洗涤缓冲液（~250 ml)
10 mmol/LTris-Cl(pH7.1)
30 mmol/LNaCl
柱洗脱缓冲液（~100 ml)
10 mmol/LTris-Cl(pH7.5)
10 mmol/L麦芽糖
柱洗涤缓冲液（~250 ml)
10 mmol/L Tris-Cl(pH7.1)
1mol/L NaCl
MgCl2(0.1 mmol/L,~250 ml)
PMSF(100mmol/L)
17.4 mgPMSF溶于1 ml异丙醇，-20°C贮存。
PMSF在水洧液中易失活，失活速率随水溶液pH值的升高而升高，而且在25°C比在4°C失活快。20mmol/LpH8.0的PMSF 水溶液的半衰期是35 min左右（James1978), 这么短的半衰期意味着碱性(pH>8.6)PMSF水溶液在室溫贮存数小时后可以安全丢弃。
可向 Boehringer Mannheim 公司购买 PMSF 替代品（4-[2-氨基乙基]-苯磺酰氟, 盐酸盐；Pefabloc SC),Pefabloc 是不可逆丝氨酸蛋白酶抑制剂，使用浓度与 PMSF 相同，但无毒性，而且在水溶液中稳定。
1XSDS 凝胶加样缓冲液
不含 DTT 的 1xSDS 凝胶加样缓冲液室溫保存，1mol/LDTT 贮存液现用现加于上述缓冲液。
Tris-Cl(10 mmol/L,pH7.1)
酶和缓冲液
DNase(5 mg/ml)
溶菌酶
RNase(5 mg/ml)
凝血酶、肠激酶或 Xa 因子溶液
溶液的配制和贮存参照生产商手册。
凝胶
SDS-聚丙烯酰胺凝胶（10%)
用于分离蛋白的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备参考附录 8。
离心机和转头
Beckman Ti60 转头或相当的转头
Sorvall GSA 转头或相当的转头
Sorvall SS-34 转头或相当的转头
特别配备
直链淀粉琼脂糖
可以参照 Kdlermann 和 Ferenci(1982) 的方法合成，也可以向 New England Bioland 公 SJ 购买（每毫升柱床体积结合 1~4 mg MBP）。
沸水浴
超声仪器
参见附录 8。
—次性 Nalgene 滤器（0.45um 硝酸纤维素膜）
载体和细菌菌株
表达 BMP 融合蛋白的大肠杆菌细胞（方案 1 或 2 的步骤 17 所制备的细胞沉淀)。
方法
直链淀粉琼脂糖柱的准备
1.4°C 悬于 10 mmol/LTris-Cl(pH7.1) 的直链淀粉琼脂糖装 3 cmX6 cm 柱。
制备细胞抽提物
2. 细胞沉淀悬于相当于原培养物 1/10 体积（一般为 50 ml) 的冰冷的细胞洗涤缓冲液,4°C 5000 g(5500r/min Sovall GSA 转头）离心 15 min 收集细胞沉淀，再悬于相当于原培养物 1/10 体积（一般为 50 ml) 的冰冷的细抱洗涤缓冲液。
3. 制备细胞裂解物
如果所用载体不带 MBP 信号肽序列（pMAL-c2)
a. 超声破碎细胞, 功率 30W, 保持细胞低温（0°C)。
b. 为使溶液澄清，加入 PMSF 至终浓度 1 mmol/L, 于 4°C 以 87000 g(35000r/min Beckman Ti60转头）离心 30 min。
继续步骤 4, 直链淀粉琼脂糖层析从上清中纯化融合蛋白。
如果所用载体带有 MBP 言号肽序列（pMAL-p2)
a.4°C5000 g(5500r/min Sorvall GSA 转头）离心 15 min 收集细胞，沉淀悬于相当于原培养物 1/20 体积（一般为 25 ml) 的冰冷的细胞裂解缓冲液。
b. 加入 PMSF 至终浓度 1 mmol/L，室温搅动 15 min, 于 4°C 以 17200 g(12000r/min Sorvall SS-34 转头）离心 10 min 收集细胞。
c. 旋动细胞沉淀，加入冰冷的 0.1 mmol/LMgCl2 溶液（每升培养物加 lOOml),4°C 揽动 10 min。
d. 休克细胞 4°C17200 g(12000r/min Sorvan SS-34 转头）离心 10 min, 在上清中加入 lOmmol/L Tris-Cl(pH7.1) 至 pH 达到 7.1。
e. 上清用 100 ml—次性 Nalgene 滤器（0.45um 硝酸纤维素膜）过滤，滤液用 100 倍体积的 10 mmol/LTris-Cl(pH7.1)4°C 透析。继续步骤 4, 直链淀粉琼脂糖层析从上清中纯化融合蛋白。
纯化融合蛋白
4. 步骤 3 获得的上清上柱，100 ml10 mmol/LTris-Cl(pH7.1) 漂洗，100 ml 柱洗涤缓冲液冲洗。
5. 用 50 ml 柱洗脱缓冲液洗脱结合的融合蛋白，每份 1 ml 分步收集。
6.SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析融合蛋白的分布，合并含融合蛋白的样品并贮存于-70°C。
7. 用适当的蛋白酶切割融合蛋白释放靶蛋白。
a. 加入凝血酶、肠激酶或 Xa 因子（根据融合蛋白中的位点选择)。每毫升树脂加入 50 单位的溶于 lmlPBS 的蛋白酶。颠倒离心管数次混勻，室温下振荡 2~16 h。用小规模试验确定获得最高产量所需时间。
b.4°C 以 500 g(2100r/min Sorvall SS-34 转头）离心 5 min, 上清小心转移到新管中。
用传统的层析方法或 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离靶蛋白和蛋白酶。
相关文章
