用碱性磷酸酶启动子和信号序列分泌表达外源蛋白实验
最新修订时间：2024-05-13材料与仪器大肠杆菌菌株 pTA1529 或 pBAce 阳性对照质粒考马斯亮蓝染色溶液或银染溶液 微量营养 MOPS 盐 中性
最新修订时间：
材料与仪器
大肠杆菌菌株 pTA1529 或 pBAce 阳性对照质粒
考马斯亮蓝染色溶液或银染溶液 微量营养 MOPS 盐 中性磷酸盐缓冲液 SDS 凝胶加样缓冲液 SDS-聚丙烯酰胺凝胶 靶基因或 cDNA 片段 诱导培养基 LB 琼脂平板 LB 培养基
Sorvall GSA 转头或相当的转头 Sorvall SS-34 转头或相当的转头 沸水浴
考马斯亮蓝染色溶液或银染溶液 微量营养 MOPS 盐 中性磷酸盐缓冲液 SDS 凝胶加样缓冲液 SDS-聚丙烯酰胺凝胶 靶基因或 cDNA 片段 诱导培养基 LB 琼脂平板 LB 培养基
Sorvall GSA 转头或相当的转头 Sorvall SS-34 转头或相当的转头 沸水浴
步骤
材料
缓冲液和溶液
贮存液，缓冲液和试剂的成分参见附录 1。
贮存液稀释至适当浓度。
考马斯亮蓝染色溶液或银染溶液
参见附录 8。
微量营养（用于 10xMOPS 盐）
37 mg（NH4)6Mo7O24•4 H2O
84 mgCoCl2
158 mgMnCl2•4 H20
247 mgH3BO3
25 mgCuSO4
18 mgZnSO4
溶于10ml 终体积，过滤除菌，贮存于 4°C。
10XMOPS 盐（用于诱导培养基）
400 mmol/L3-(N-吗啉代) 丙磺酸（pH7T4)(MOPS)
40 mmol/L 麦黄酮 (pH7.4)
0.1 mmol/L FeSO4•7 H2O
95 mmol/LNH4Cl
2.8 mmol/LK2SO4
5umol/LCaCl2•2 H2O
5.3 mmol/LMgCl2•6 H2O
0.5mol/NaCl
溶于 1L 终体积，过滤除菌. 用前每升加 10ul 微量营养。
中性磷酸盐缓冲液（1mol/L)(用于诱导培养基)
1 mmol/LNa2 HPO4 和 1 mmol/L NaH2PO4 等摩尔灌合。
1XSDS 凝胶加样缓冲液
不含 DTT 的 1xSDS 凝胶加样缓冲液室温保存，1mol/LDTT 贮存液现用现加于上述缓冲液。
凝胶
SDS-聚丙烯酰胺凝胶（10%）
用于分离蛋白的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶制备参考附录 8。
核酸和寡核苷酸
靶基因或 cDNA 片段
培养基
诱导培养基
1xMOPS 盐 (配方见上）
0.2%(m/V) 葡萄糖
0.2%(m/V) 酪蛋白水解物(维生素分析级；DIFCO 公司)
20ug/ml 腺嘌呤
0.5ug/ml 硫胺
0.1mol/L 中性磷酸盐缓冲液（配方见上）
由各自贮存液混合配成 1 升水溶液，过滤除菌，贮存于 4°C。
诱导 phoA 的低磷酸盐培养基 (Neidhardt et al,1974; 最初用于同位素标记）虽然配制麻烦，担总能获得最高水乎的诱导。
含氨苄（50ug/ml) 的 LB 琼脂平板
含氨苄（50ug/ml) 的 LB 培养基
离心机和转头
Sorvall GSA 转头或相当的转头
Sorvall SS-34 转头或相当的转头
特别配备
沸水浴
补充试剂
本方案步骤 1 需要笫 8 章方案 7 中所列试剂。
本方案步骤 2 需要第 1 章方案 17 或 19 中所列试剂。
本方案步骤 3 需要第 1 章方案 23~26 中所列试剂。
本方案步骤 4 需要第 12 章方案 3 中所列试剂。
载体和细菌菌株
大肠杆菌菌株
任何大肠杆菌菌株都可用作载体的宿主。Oka 等（1985）报道外源蛋白在 YK537 中比在 C600 中表达量髙 5 倍，YK537 菌株带有内部缺失突变的如 phoA 基因，但表达水平的差异可能并不是由突变造成的，因为 B.L.Wanner(个人通信）等发现外源蛋白在同基因野生型或 phoA8 菌株中的表达没有差异。如果外湎蛋白没有毒性，就可以使用带 phoR 突变的细菌菌株。因为野生型 phoR 基因编码操纵子的阻抑物，phoR 突变株组成表达/启动子控制的基因（Wanner1987)。对于所有的细菌表达系统可能都需要试用不只一种宿主，才能找到最适于表达特定外源蛋白的大肠杆菌菌株（Weikert et al.1988)。不同的菌株也应在不同的溫度培养，以获得最高表达水平和蛋白稳定性（见方案 1)。
pTA1529 或 pBAce
质粒 pTAl529 由 Oka 等（1985) 构建；pBAce 由 C.C.Wang(Department of Pharmaceutical Chemistry,University of Caliafornia,SanFrancisco) 构建。
阳性对照质粒（表达已知大小的 LacZ 融合蛋白的 IPTG 诱导载体）
方法
含重组表达载体的大肠杆菌菌株的构建
1.PCR 修饰或限制性内切酶消化分离 DNA 片段，片段 5'端和 3'端带有与 pTA1529 或 pBAce 对应的限制酶位点。
为确定扩增反应没有引入错误突变，应对 PCR 产物进行序列分析。
2. 含靶 cDNA/基因的 DNA 片段与表达载体连接（第 1 章方案 17 或 19)。
3. 连接产物转化适当的大肠杆菌菌株。将转化体铺于含氨苄（50ug/ml) 的 LB 平板，于 37°C 过夜培养。
空的表达质粒转化相同的大肠杆菌菌株作阴性对照。
4. 通过菌落杂交和/或小量制备质粒的限制酶切分析、寡核苷酸杂交或序列分析筛选带有插入片段的转化体（请参见第 12 章方案 3)。
诱导靶蛋白表达的优化
许多研究表明细胞生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种细菌量、诱导前细胞生长时间和诱导后细胞密度进行控制。生长过度或过速都会加重细菌合成系统的负担，导致形成包涵体。
5. 对照菌和重组菌分别挑取 1~2 个菌落，接入 lml 含氨苄青霉素（50ug/ml) 的 LB 培养液，37°C 培养过夜。
6. 取 50ul 接入 5 ml 含氨苄青霉素（50ug/ml) 的诱导培养液，20~37°C 振荡培养。
影响诱导表达的因素请参见方案 1 步骤 8 的注解。
7. 接种后不同时间（如 0、6、12、18 和 24 h) 取 1 ml 样品放于微量离心管中，测定 A550, 室温高速离心 1 min。
phoA 启动子的诱导比其他启动子慢，因为诱导是随着培养基中磷黢盐的不断消耗而发生的。最佳生长溫度也因表达蛋白而异，必须通过实验确定。
8. 沉淀悬于 100ul lxSDS 凝胶加样缓冲液，100°C 加热 3 min, 室温高速离心 1 min, 冰上放置，待全部样品处理完后上样。
9. 样品加热至室温，取 40ug 或相当于 0.15OD550 培养物的悬液上样于 10%SDS 聚丙烯酰胺凝胶。
10.8~15V/cm 电泳，至溴酚兰迁移到分离胶底部。
11. 考马斯亮蓝染色或银染，或免疫印迹，观察表达产物条带（见附录 8)。
如果用 phoA 信号肽引导外源蛋白的分泌，进行补充方案 phoA 融合蛋白的亚细胞定位，通过分级分离分析蛋白在细胞中的分布。
大量表达靶蛋白
12. 挑取一个重组大肠杆菌菌落接入 25 ml 含氨苄（50ug/ml) 的 LB 培养液，在 125 ml 摇瓶中于 37°C 通气培养过夜。
13.5000 g(6500r/min Sorvall SS-34 转头）离心 15 min 收集细胞，沉淀重悬于 25 ml 诱导培养液，再次离心收集细胞。
14. 洗涤过的细胞重悬于 2.5 ml 诱导培养液，接种于 500 ml 诱导培养液，以预试验确定的最佳时间和最佳温度于 2L 摇瓶中培养。
15. 诱导适当时间后，于 4°C 以 4000 g(5000r/min Sorvall GSA 转头）离心 15 min 收集细胞。
如果使用带信号肽序列的 phoA 表达载体, 而且补充方案结果表明外源蛋白位于周质中. 用补充方案中介绍的渗透休克的方法纯化表达产物；如果所用载体不带信号肽序列用传统的层析方法纯化外源蛋白。
缓冲液和溶液
贮存液，缓冲液和试剂的成分参见附录 1。
贮存液稀释至适当浓度。
考马斯亮蓝染色溶液或银染溶液
参见附录 8。
微量营养（用于 10xMOPS 盐）
37 mg（NH4)6Mo7O24•4 H2O
84 mgCoCl2
158 mgMnCl2•4 H20
247 mgH3BO3
25 mgCuSO4
18 mgZnSO4
溶于10ml 终体积，过滤除菌，贮存于 4°C。
10XMOPS 盐（用于诱导培养基）
400 mmol/L3-(N-吗啉代) 丙磺酸（pH7T4)(MOPS)
40 mmol/L 麦黄酮 (pH7.4)
0.1 mmol/L FeSO4•7 H2O
95 mmol/LNH4Cl
2.8 mmol/LK2SO4
5umol/LCaCl2•2 H2O
5.3 mmol/LMgCl2•6 H2O
0.5mol/NaCl
溶于 1L 终体积，过滤除菌. 用前每升加 10ul 微量营养。
中性磷酸盐缓冲液（1mol/L)(用于诱导培养基)
1 mmol/LNa2 HPO4 和 1 mmol/L NaH2PO4 等摩尔灌合。
1XSDS 凝胶加样缓冲液
不含 DTT 的 1xSDS 凝胶加样缓冲液室温保存，1mol/LDTT 贮存液现用现加于上述缓冲液。
凝胶
SDS-聚丙烯酰胺凝胶（10%）
用于分离蛋白的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶制备参考附录 8。
核酸和寡核苷酸
靶基因或 cDNA 片段
培养基
诱导培养基
1xMOPS 盐 (配方见上）
0.2%(m/V) 葡萄糖
0.2%(m/V) 酪蛋白水解物(维生素分析级；DIFCO 公司)
20ug/ml 腺嘌呤
0.5ug/ml 硫胺
0.1mol/L 中性磷酸盐缓冲液（配方见上）
由各自贮存液混合配成 1 升水溶液，过滤除菌，贮存于 4°C。
诱导 phoA 的低磷酸盐培养基 (Neidhardt et al,1974; 最初用于同位素标记）虽然配制麻烦，担总能获得最高水乎的诱导。
含氨苄（50ug/ml) 的 LB 琼脂平板
含氨苄（50ug/ml) 的 LB 培养基
离心机和转头
Sorvall GSA 转头或相当的转头
Sorvall SS-34 转头或相当的转头
特别配备
沸水浴
补充试剂
本方案步骤 1 需要笫 8 章方案 7 中所列试剂。
本方案步骤 2 需要第 1 章方案 17 或 19 中所列试剂。
本方案步骤 3 需要第 1 章方案 23~26 中所列试剂。
本方案步骤 4 需要第 12 章方案 3 中所列试剂。
载体和细菌菌株
大肠杆菌菌株
任何大肠杆菌菌株都可用作载体的宿主。Oka 等（1985）报道外源蛋白在 YK537 中比在 C600 中表达量髙 5 倍，YK537 菌株带有内部缺失突变的如 phoA 基因，但表达水平的差异可能并不是由突变造成的，因为 B.L.Wanner(个人通信）等发现外源蛋白在同基因野生型或 phoA8 菌株中的表达没有差异。如果外湎蛋白没有毒性，就可以使用带 phoR 突变的细菌菌株。因为野生型 phoR 基因编码操纵子的阻抑物，phoR 突变株组成表达/启动子控制的基因（Wanner1987)。对于所有的细菌表达系统可能都需要试用不只一种宿主，才能找到最适于表达特定外源蛋白的大肠杆菌菌株（Weikert et al.1988)。不同的菌株也应在不同的溫度培养，以获得最高表达水平和蛋白稳定性（见方案 1)。
pTA1529 或 pBAce
质粒 pTAl529 由 Oka 等（1985) 构建；pBAce 由 C.C.Wang(Department of Pharmaceutical Chemistry,University of Caliafornia,SanFrancisco) 构建。
阳性对照质粒（表达已知大小的 LacZ 融合蛋白的 IPTG 诱导载体）
方法
含重组表达载体的大肠杆菌菌株的构建
1.PCR 修饰或限制性内切酶消化分离 DNA 片段，片段 5'端和 3'端带有与 pTA1529 或 pBAce 对应的限制酶位点。
为确定扩增反应没有引入错误突变，应对 PCR 产物进行序列分析。
2. 含靶 cDNA/基因的 DNA 片段与表达载体连接（第 1 章方案 17 或 19)。
3. 连接产物转化适当的大肠杆菌菌株。将转化体铺于含氨苄（50ug/ml) 的 LB 平板，于 37°C 过夜培养。
空的表达质粒转化相同的大肠杆菌菌株作阴性对照。
4. 通过菌落杂交和/或小量制备质粒的限制酶切分析、寡核苷酸杂交或序列分析筛选带有插入片段的转化体（请参见第 12 章方案 3)。
诱导靶蛋白表达的优化
许多研究表明细胞生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种细菌量、诱导前细胞生长时间和诱导后细胞密度进行控制。生长过度或过速都会加重细菌合成系统的负担，导致形成包涵体。
5. 对照菌和重组菌分别挑取 1~2 个菌落，接入 lml 含氨苄青霉素（50ug/ml) 的 LB 培养液，37°C 培养过夜。
6. 取 50ul 接入 5 ml 含氨苄青霉素（50ug/ml) 的诱导培养液，20~37°C 振荡培养。
影响诱导表达的因素请参见方案 1 步骤 8 的注解。
7. 接种后不同时间（如 0、6、12、18 和 24 h) 取 1 ml 样品放于微量离心管中，测定 A550, 室温高速离心 1 min。
phoA 启动子的诱导比其他启动子慢，因为诱导是随着培养基中磷黢盐的不断消耗而发生的。最佳生长溫度也因表达蛋白而异，必须通过实验确定。
8. 沉淀悬于 100ul lxSDS 凝胶加样缓冲液，100°C 加热 3 min, 室温高速离心 1 min, 冰上放置，待全部样品处理完后上样。
9. 样品加热至室温，取 40ug 或相当于 0.15OD550 培养物的悬液上样于 10%SDS 聚丙烯酰胺凝胶。
10.8~15V/cm 电泳，至溴酚兰迁移到分离胶底部。
11. 考马斯亮蓝染色或银染，或免疫印迹，观察表达产物条带（见附录 8)。
如果用 phoA 信号肽引导外源蛋白的分泌，进行补充方案 phoA 融合蛋白的亚细胞定位，通过分级分离分析蛋白在细胞中的分布。
大量表达靶蛋白
12. 挑取一个重组大肠杆菌菌落接入 25 ml 含氨苄（50ug/ml) 的 LB 培养液，在 125 ml 摇瓶中于 37°C 通气培养过夜。
13.5000 g(6500r/min Sorvall SS-34 转头）离心 15 min 收集细胞，沉淀重悬于 25 ml 诱导培养液，再次离心收集细胞。
14. 洗涤过的细胞重悬于 2.5 ml 诱导培养液，接种于 500 ml 诱导培养液，以预试验确定的最佳时间和最佳温度于 2L 摇瓶中培养。
15. 诱导适当时间后，于 4°C 以 4000 g(5000r/min Sorvall GSA 转头）离心 15 min 收集细胞。
如果使用带信号肽序列的 phoA 表达载体, 而且补充方案结果表明外源蛋白位于周质中. 用补充方案中介绍的渗透休克的方法纯化表达产物；如果所用载体不带信号肽序列用传统的层析方法纯化外源蛋白。
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