液体培养液中裂解感染实验

λgtll 重组噬菌体 大肠杆菌 Y1090 hsdR 菌株
细胞裂解液 IPTG MgS04•7 H20 苯甲基磺酰氯 SM LB 培养液
SorvallSS-34 转子或同等产品 沸水水浴 液氮

材料

缓冲液剂及溶液

贮存液，缓冲液及试剂的组分见附录 1。
将贮存液稀释至合适浓度。

细胞裂解液（每个分析的噬斑需 100ul)

50 mmol/L Tris-Cl (pH6.8)
100 mmol/L 二硫苏糖酵
2%(m/V)SDS
0.1%(m/V) 溴酚蓝
10%(V/V) 甘油

IPTG(1mol/L)(每个分析的噬斑需 70ul)

MgS04•7 H20(1mol/L)

苯甲基磺酰氯（PMSF)(100 mmol/L)

SM
用完后弃掉以防污染。

凝胶

SDS-聚丙烯酰胺凝胶
请见步骤 12。

培养液

含 50ug/ml 氨苄青霉素的 LB 培养液

离心机及转子

SorvallSS-34 转子或同等产品

专用设备

沸水水浴

液氮

载体及细菌菌株

λgtll 重组噬菌体
制备λ重组噬菌体贮存液：单个噬斑放入约 1mlSM 中室温放置 2 h 成通过制备平板裂解液來制备（见第 2 章方案 3)。

大肠杆菌 Y1090 hsdR 菌株
此菌株可通过 ATCC(www.atcc.ors) 获得，关于大肠杆菌 Y1090 菌株有关信息，见本章信息栏中质粒及λ噬菌体表达载体相关内容。

方法

1. 取大肠杆菌 Y1090 hsdR 菌株单个菌落接种到 50 ml 含 50ug/ml 氨苄青霉素的 LB 培养液中，37°C 过夜培养，并不断温和振荡（摇床 250r/min)。

2. 将培养液转移至离心管中，室温下 4000 g(SarvallSS-34 型转子 58OOr/min) 离心10min。

3. 弃上清，用 25 ml10mmol/LMgS04 重悬细胞，使用前将细菌悬液置于冰上保存。

4. 在 15 ml 无菌管中，将 8 ml 含 50ug/ml 氨苄青霉素的 LB，400ul 细菌悬液及 100ul 噬菌体裂解液混合。
因为融合蛋白质是从感染细胞本身分离的而非裂解液（见方案 8), 因此有必要获得目的λ噬菌体的高产量感染同时避免培养物的过早溶菌现象。由此. 在操作过程中，常使用低感染复数（毎 16000 细胞约 1 pfu)。

5. 将管放于 37°C 水浴中振荡 2 h。

6. 每份培养物取 lml 到无菌微量离心管中，盖紧管盖，存于液氮中。向剩余感染的培养物中加 70ul 1mol/LIPTG,37°C 继续培养。

7. 每隔 1 h, 每份感染的细胞培养物取 1 ml 转到微离心管中，盖紧管盖，存于液氮中。通过此方式，收集 4 h 内的小份培养液。

8. 剩余的感染培养物 37°C 继续温育 12 h, 从每份培养物中最后一次取 lml 样品，盖紧管盖，液氮中放 30 min。

9. 融化所有样品，于室温最大速度离心 1 min, 收集感染的细菌，去掉细菌培养液。

10. 每管中加 100ul 裂解缓冲液，强烈涡旋迅速重悬细胞。

11. 将样品放入沸水中 3 min, 转到室温加 1ul 100 mmol/LPMSF, 振荡混勻。

12. 用 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳与免疫印迹直接分析样品。电泳前，样品在微离心机中最大转速 1 min, 取 25 上清液加到 SDS-聚丙烯凝胶上或放到-70°C 保存直至使用。
用 IPTG 处理培养物后目的融合蛋白的量在 1~4 h 内是逐步增高的。此后，蛋白质的量虽可能增加，可能保持不变，也可能因感染的细胞裂解释放蛋白质到培养物中而降低。