上样并进行 DNA 测序实验

缓冲液和溶液 0.5XTBE 和 或 1XTBE 凝胶 核酸和寡核苷酸
自动微量加液器 牛头夹 凝胶温度监测条 巴斯德吸管 带塑料涂层的金属板 稳压电源 解剖刀片 鲨鱼齿梳 注射器 85°C 水浴和 100°C 烘箱

材料

缓冲液和溶液
贮存液. 缓冲液和试剂的成分见附录 1。
稀释贮存液到合适的浓度。

0.5XTBE 和/或 1XTBE

凝胶
变性聚丙烯酰胺凝胶
已经在第 8、9、10 节中介绍过

核酸和寡核苷酸

DNA 测序反应
见方案 3~7 的阐述。

特殊设备

自动微量加液器（20ul)
微量加液器应该配备一套毛细吸管头（如，Multi-Flex) 或其他的加样设备（见测序胶加样第 8 步内容)。

牛头夹（5 cm 长，每块胶 5~7 个）

凝胶温度监测条
这些条是 TLC（thermochromic liquid crystal) 指示物，在电泳的过程中当凝胶的温度升髙时它们会改变颜色。包括 BioWhittaker 在内的几家商业公司出售温度监测条。

巴斯德吸管

带塑料涂层的金属板
任选. 见步骤 2。

能供应大于 75W 的稳压电源
带有自动线路转换的大多数电源都能提供稳定的电压、功率或电流。一个配有多套输出装置的电源有在 7000V 输出 300W 的稳定功率的能力，它能很容易同时地进行两个或三个测序电泳。

带可调换式刀片的解剖刀片
这刀片是用来从测序胶模上取下绝缘带的，有时也用来从加样板上刮下残留的聚丙烯酰胺。

解剖刀片
许多型号的电泳仪上的槽都是通用的。尽管依据同样的设计，但是生产商之间在玻璃板和垫片上的安排还是不同的。大部分商业设备运行的都比较好，生产商的选择主要是个人的选择。然而，作者建议最好购买带固定金属板的设备。这些金属板一般是铝制的，它们可通过凝胶表面把由电阻产生的热量散布掉，从而阻止在凝胶的边缘出现「笑脸（smiling）假象。

鲨鱼齿梳（0.4 mm 厚，有 32，64 或 96 个齿，视电泳仪的要求而定）
在让凝胶成型的过程中用同一个齿梳很必要的。

注射器（10cc) 和 22 号皮下针头

85°C 水浴和 100°C 烘箱
当测序反应在微量滴定板上进行时水浴。而当反应在毛细管中进行吋要用烘箱。

方法

警告：在实际操作中很大的电压施加在 DNA 铡序胶上。过强的电流能引起严重的烧伤、心脏肌纤维震颤、呼吸中枢停止，窒息是由于呼吸肌的麻痹造成的。一定要确认：用于电泳的凝胶盒是绝缘的，所有缓冲液槽都盖好了，凝胶被放在一个干燥稳定的实验台了。在加样或取凝胶前都要关闭电源。

1. 用湿的纸巾或一块湿的海绵把任何干的聚丙烯酰胺从胶模上擦去。用移液管吸几毫升的 1XTBE 缓冲溶液沿较小的或有切口的玻璃板加入，一边慢慢地从凝胶上移走梳子。用解剖刀片把绝缘胶带切开，把它从胶模的底部剥去。不要从胶的边缘把它移开。

2. 按照生产商的说明用牛头夹把胶模固定在电泳仪上，用带塑料涂层的实验室用夹子或者用电泳仪固有的螺旋夹。一般较小的或者有切口的板应该和电泳仪直接接触, 而较大的没有槽的应直接对着观察者。
在电泳期间如果电泳仪没有金属板散去电泳产生的热量，就加一块金属板，比如一块带塑料涂层的铝板，把它裁成和无槽玻璃板一样的尺寸散热效果就很好并且重量很轻。

3. 用合适的缓冲液把电泳仪的上下槽加满。
对于标准或含有甲酰胺的凝胶

a. 用 1XTBE 添满上下槽。下槽的缓冲液高度应刚好超过玻璃板的底部。上槽的缓冲液高度应刚好超过有切口比较小的板的上缘，并同胶直接接触。

b. 用装好 lxTBE 的 10 ml 注射器冲洗胶的顶部，以从胶上除去多余的聚丙烯酰胺和尿素。如果必要的话，用注射针把玻璃板上的所有聚丙烯酰胺碎片都刮掉。
用巴斯德吸管把附着在下槽玻璃板底的气泡赶走。

c. 将电极与电泳装置相连，然后供电。阴极（黑色）应连到上槽上，阳极（红色）连底部，连上固有的温度感受器（如有）或温度监测条。在 50~70W 的恒定电压下电泳约 45 min 或者直到胶的温度达到 45~50°C 为止。切断电源，拆开电极。

对电解质梯度凝胶

a. 上槽用 0.5XTBE 灌满，下槽用由 2 倍体枳 1XTBE 加上 1 倍体积的醋酸钠组成的混合溶液（见方案 10) 灌满。

b. 用 0.5XTBE 冲洗，同上除去尿素/聚丙烯酰胺。不要预电泳电解质梯度凝胶。

4. 将含有测序反应物的毛细管放在 100°C 的烘箱里培养 2 min。如果反应在微量滴定板上已经完成就打开微世滴定板盖，将无盖的滴定板漂在 85°C 的水浴上温浴 5 min。

5. 孵育滴定板的同时，在带有 22 号针头的 l0CC 注射器中吸满 0.5X 或 1XTBE。用力推出一些 TBE 洒在浸没在电泳液中用于加样的胶面上，以便从加样区除去任何残留的尿素和聚丙烯酰胺碎片。继续推出直到在加样区看不到残留尿素。
尿素从凝胶中快速扩散，将在孔和窄缝的底部形成垫。由于比测序反应更高的浓度. 尿素垫将取代孔底部的反应物。取代的结果是 DNA 片段不均的迁移到凝胶里并呈不规则的序列阶梯。

6. 轻轻地把鲨鱼齿梳插入（齿向下）加样孔，把鲨鱼齿梳向下推直到齿刚好穿透凝胶的表面。

7. 把细丝管或微量滴定板盖从水浴或烘箱中移到冰中。在被加到凝胶上之前将样品保持在 0°C。快速冷到低温是为了延迟模板和放射性标记链之间的复性。

8. 从每种测序反应物中取 1~5ul(见方案 3~7 介绍的体积）加样于凝胶上相邻的槽中。
见测序凝胶加样。
样品将流入小孔在聚丙烯酰胺表面形成一条紧密的带，记录模板的顺序并注意使每套样品均按相同的次序加样。
可以把一份旧的测序反应物加到凝胶边缘额外的加样槽里作为界限，以便准确无误地分清最终放射自显影片的左右方向。




9. 当所有的样品都加完后，将电源和电极设备相连接：负极（黑）接上槽，阳极（红)接下槽。凝胶电泳应在足够恒定的功率下进行以维持 45~50°C 的温度。



10. 依靠目的序列和寡核苷酸引物之间的距离，当第一次加样的缓冲液中的溴酚蓝迁移出标准或含甲酰胺的变性聚丙烯酰胺凝胶约 15 min 后（1.5~2.0h) 进行第二次加样，再度将测序反应物加于凝胶之上。第一次加样得到的序列离引物较远，而第二次加样得到的序列更为接近。用这种二次加样的方法可以使可读序列的长度扩展约 35%。

a. 关掉电源并把测序装置和电源分开。

b. 移掉上下槽的电泳缓冲液。

c. 如上步骤 4 介绍的那样将样品热变性。

d. 加样。

e. 重新把测序装置和电源连接。

f. 进行电泳，如前一样，在足够恒定的功率下保持温度在 45~50°C。
作为一种选择，在电泳进行的合适阶段，通过用由 2 份 1XTBE 和 1 份 3mol/L 乙酸钠组成的缓冲液取代下槽的电泳缓冲液可以扩大可读序列的长度。

11. 在电泳的最后，按照在方案 12 介绍的步骤取下凝胶，进行放射自显影。