重组质粒的连接、转化及筛选

用特定的限制性内切酶切割载体DNA和外源DNA片段并进行纯化，于体外使两者相连接(若用T-载体，可直接用纯化的PCR产物进行连接)，转化宿主细菌后，利用蓝白斑筛选原理对重组子进行挑选。由于载体上带有Amp'和lacZ基因，故重组子的筛选采用Amp抗性筛选与α-互补原理筛选相结合的方法。

初步的抗性筛选：载体上带有Amp'基因而外源片段上没有，故转化受体菌后只有带有载体DNA的转化子才能在含有Amp的LB平板上存活下来，而带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活。

进一步蓝白斑筛选：载体上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点，但并没有破坏lacZ

的阅读框架，不影响其正常功能。E.coli DH5α、Top10或JM系列菌株带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下，载体和菌株编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在载体和菌株融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶突变体之间实现互补的现象叫α-互补。由α-互补产生的Lac+细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到载体的多克隆位点后会导致读码框改变，表达蛋白失活，产生的氨基酸片段失去α-互补能力，因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。

一、连接反应

将约10ng的载体DNA转移到无菌微量离心管中，加入至少4倍摩尔量的外源DNA片段，然后加入10×T4 DNA连接酶缓冲液（ligase buffer）1μL，T4 DNA连接酶0.5μL——1μL，加无菌超纯水至10μL体积，充分混匀后用微量离心机将液体全部收集至管底，于16℃保温过夜。

二、E.coli DH5α感受态细胞的转化

1. 从一70℃冰箱中取200μL（效率高时只需50μL）感受态细胞悬液，置冰上解冻。

2. 待感受态解冻后加入连接产物溶液1IxL——51xL，轻弹混匀，冰上放置30rain。

3. 42℃水浴中孵育90s，并迅速置冰上冷却3min——5min。

4. 向管中加入lmL LB液体培养基（不含Amp），混匀后37℃振荡培养lh，使细菌恢复生长，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Amp'）。

5. 将上述菌液摇匀后取100μL（如感受态效率低或连接效率低则可将lmL菌液在4500 rpm低转速离心机中收集全部菌体，并重悬于100μL LB培养液中）涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，将培养皿倒置于37℃培养16h——24h。

①同时做三个对照

对照1：以等体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，涂板时只取5μL菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。

对照2：以等体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，涂板时只取5μL菌液涂布于含有抗生素的LB平板上。此组正常情况下应没有菌落出现。

对照3：取一定量已知浓度的对照质粒DNA（为本实验中的连接载体质粒）加入等量感受态细胞中，其他操作与加入连接体系的相同。此对照在正常情况下应在含抗生素的LB平板上出现较大量的菌落。

②统计每个培养皿中的菌落数

转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：

转化子总数=菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积

转化频率（转化子数/mg质粒DNA）=转化子总数/质粒DNA加入量（mg）

感受态细胞总数=对照组1菌落数×稀释倍数×菌液总体积/涂板菌液体积

感受态细胞转化效率=转化子总数/感受态细胞总数

三、重组质粒的筛选与鉴定

带有T-vector的空载体的转化子由于具有β-半乳糖苷酶活性，在X-gal和IPTG培养基上为蓝色菌落；带有重组质粒转化子由于外源DNA片段的插人丧失了β-半乳糖苷酶活性，因而在X-gal和IPTG培养基上为白色菌落。

1. 质粒电泳初步鉴定重组子

用无菌牙签挑取白色单菌落接种于含Amp 50μg/mL的5mL LB液体培养基中，于37℃振荡培养12h。用碱裂解法小量制备质粒DNA进行电泳，同时制备T-vector做对照，有插人片段的重组质粒电泳时迁移率较T-vector慢。

2. 质粒酶切确定重组子

用与连接未端相对应的限制性内切酶对以上电泳中迁移率较慢的质粒进一步进行酶切检验，同时对空载体进行对照酶切，如果确实插人了外源DNA片断，就能在电泳中看到与插入片断大小一致的DNA条带。

1. T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase）及连接反应缓冲液（10×），购自公司。

2. 相应的内切核酸酶（用于酶切片段和载体及随后鉴定重组子），购自公司。

3. X-gal贮液（20mg/mL）：直接购买溶液，或用二甲基甲酰胺溶解X-gal固体配制成

20mg／mL的贮液，包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏，贮存于-20℃。

4. IPTG贮液（200mg／mL）：在800μL蒸馏水中溶解200mg IPTG后，用蒸馏水定容至

1mL，用0.22 μm滤膜过滤除菌，分装于离心管并贮于-20℃。

5. 含X-gal和IPTG的筛选培养基：在涂布转化子之前，于事先制备好的含100μg/mL

Amp的LB平板表面加40mL X-gal贮液和4μL IPTG贮液，用无菌玻璃涂布器将溶液涂匀，置于37℃下放置3h一4h，使培养基表面的液体完全被吸收。

6. 碱裂解法小量制备质粒试剂。

7. 特定的限制性核酸内切酶及电泳试剂。

常见问题分析及处理：

由于此实验过程涉及多个实验环节，如酶切、连接、感受态细胞、转化等各方面的效率，因此在实验中经常会出现一些问题。如：

1. 对照1上有大量菌落；对照2上无菌落；对照3上无菌落或有少量菌落；连接体系转化

平板上无菌落。可能是感受态细胞效率太低所造成，重新制备高效率感受态。

2. 对照1上有大量菌落；对照2上无菌落；对照3上有较大量菌落；连接体系转化平板上

无菌落。可能说明连接效率太低造成，重新调节连接体系以提高连接效率。

3. 对照1上有大量菌落；对照2上也有菌落；对照3上有菌落；连接体系转化平板上有菌

落。可能说明感受态细胞受到污染，用新的原始感受态细胞株制备感受态。

4. 对照1上有大量菌落；对照2上无菌落；对照3上有较大量菌落；连接体系转化平板上

有适量菌落，但只有蓝色菌落，无白色菌落。可能说明连接体系的效率太低，转化的均为载体自连质粒（T载体；或载体酶切不完全，分离纯化到的载体中含有未双酶切的片断），重新制备片段和载体，调节连接体系，提高连接效率。

5. 来源《分子生物学实验技术》。