酸性磷酸酶(ACP)的显示
目的要求 1.熟悉酸性磷酸酶显示方法的原理及操作步骤 2.观察酸性磷酸酶在细胞中的分布基本原理 酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)主要存在于
目的要求 1.熟悉酸性磷酸酶显示方法的原理及操作步骤 2.观察酸性磷酸酶在细胞中的分布
基本原理 酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)主要存在于巨噬细胞,定位于溶酶体内。在溶酶体膜稳定完整时,底物不易渗入,ACP活力微弱或无活性,经固定,在合适pH条件下,膜本身变为不稳定,逐渐改变其渗透性,底物可以渗入,酶活力被显示。 ACP在酸性条件下(pH4.7)可使作用液中的底物β-甘油磷酸钠的磷酸根解离出来,进而与溶液中硝酸铅结合形成磷酸铅沉淀,因其是难溶解的无色沉淀物,需要与黄色的硫化铵作用,生成棕黑色PbS沉淀而被显示出来。 β-甘油磷酸钠→甘油+PO 3- PO 4 +Pb(NO 3 ) 2 → Pb 2 (PO 4 ) 2 Pb 2 (PO 4 ) 4 +(NH 4 ) 2 S→PbS 实验用品 1.器材:注射器、解剖用具、恒温水浴锅、载玻片、盖玻片 2. 试剂 : 3%淀粉溶液;ACP作用液;2%硫化铵 3.材料:小鼠腹腔液涂片
免疫动物:实验前4~6天用无菌注射器取已灭菌的3%淀粉溶液1ml注射于小鼠腹腔内,每天一次。
颈椎脱臼处死小鼠
吸取少量腹腔液,在玻片上涂层一薄层,室温晾干。
将涂片滴置于温盒中,滴加适量ACP作用液,37℃作用30分钟。取出后, 蒸馏 水漂洗。用10%甲醛钙溶液后固定5min。