光活化的核苷酸类似物介导的RNA-蛋白的交联实验
原理光化学交联技术是研究核搪核蛋内复合物中 RNA 与蛋白的相互作用的有效手段。 其基本原理是未经任何化学修饰的 RNA -蛋白天然复合物在短波长紫外线（254
原理
光化学交联技术是研究核搪核蛋内复合物中 RNA 与蛋白的相互作用的有效手段。 其基本原理是未经任何化学修饰的 RNA -蛋白天然复合物在短波长紫外线（254 nm ) 照射时，RNA 中的核苷酸和蛋白质中的氨基酸会产生光化学反应，转变为活性状态，进而形成分子间共价交联。
材料与仪器
FPLC纯化的核苷酸 Sephadex G-50
缓冲液A 甘油 乙酰化牛血清白蛋白 缓冲液B 缓冲液C 肝素 缓冲液F 酚 氯仿 异戊醇 无RNase的DNaseI 叠氮苯酰溴 缓冲液D 缓冲液C TBE缓冲液 蛋白上样缓冲液 SDS变性聚丙烯酰胺凝胶 转移缓冲液 银染试剂
紫外光源号 离心管 X 射线片 增感屏 硝酸纤维素膜 电转移装
缓冲液A 甘油 乙酰化牛血清白蛋白 缓冲液B 缓冲液C 肝素 缓冲液F 酚 氯仿 异戊醇 无RNase的DNaseI 叠氮苯酰溴 缓冲液D 缓冲液C TBE缓冲液 蛋白上样缓冲液 SDS变性聚丙烯酰胺凝胶 转移缓冲液 银染试剂
紫外光源号 离心管 X 射线片 增感屏 硝酸纤维素膜 电转移装
步骤
―、材料与设备
1. 全长含核苷酸类似物的 RNA 合成
所有的缓冲液配制均需采用经过蒸馏并灭菌的去离子水
(1) 缓冲液 A：20 mmol/L Tris-HAc ( pH 8.0 )，10 mmol/L Mg(Ac)2，50 mmol/L 谷氨酸钾。
(2) 5% (V/V) 甘油，40 mmoI/L Na2EDTA ( pH 8.0 )，40 μg/mL 乙酰化牛血清白蛋白，-20℃ 保存。
(3) 缓冲液 B：1.5 mol/L NH4Ac，37.5 mmol/L Na2EDTA( pH 8.0 )，50 μg/ml 无RNase 的 tRNA，20℃ 保存。
(4) 缓冲液 C (2X)：8 mol/L 尿素，0.1% (m/V) 二甲苯青，0.1% (m/V) 溴酚蓝。
(5) FPLC 纯化的核苷酸，ATP，CTP，GTP，UTP，-80°C 保存。
(6) 5-SH-UTP，5-SH-CTP，5-APAS-UTP 和 5-APAS-CTP 配制成 1~3 mol/L 的水溶液，-80℃ 避光保存。
(7) T7 噬菌体 RNA 聚合酶或大肠杆菌 RNA 聚合酶。
(8) [ α-32P ] GTP 的工作浓度范围为 105 cpm/pmol~107 cpm/pmol。
(9) 1 mol/L NH4Ac 以无水乙醇配制，室温保存。
(10) 肝素：0.5 mg/ml 水溶液，-20°C 保存。
(11) 缓冲液 F：40 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.6)，15 mmol/L MgCl2，10 mmol/L β-巯基乙醇，乙酰化牛血淸白蛋白。
(12) 酚：氯仿：异戊醇（25：24：1 )。
(13) 80% (V/V) 乙醇。
(14) RQ1 无 RNase 的 DNase I ( Promega 公司）。
(15) 紫外光源号：Spectroline model XX-15B，Spectroline 公司）。
(16) 1 ml 离心管。
2. 分子表面掺入具光交联活性的核苷酸类似物的 RNA 合成
(1) 100 mmol/L 叠氮苯酰溴（Azidophenacyl bromide，APB，Sigma 公司）溶于硫酸二甲酯。
(2) Sephadex G-50，DNA 级。
(3) 缓冲液 D：30 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.0 )，10 mmol/L KCl，0.5 mmol/L Na2EDTA ( pH 8.0 )。
3. RNA 与蛋白的交联
(1) 缓冲液 C（2X）：8 mol/L 尿素，0.1%（m/V）二甲苯青，0.1%（m/V）溴酚蓝。
(2) 10X TBE 缓冲液：0.89 moI/L Tris 碱，0.89 mol/L 硼酸，20 mmol/L EDTA，室温保存。
(3) X 射线片。
(4) 增感屏。
(5) RNase T1 消化缓冲液：25 mmol/L 柠檬酸钠，1 mmol/L Na2EDTA ( pH 8.0 )，-20°C 保存。
(6) RNase T1。
(7) 2X 蛋白上样缓冲液：60 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0 )，60 mmol/L DTT，3.4% (m/V) SDS，17% (V/V) 甘油， 0.02% (m/V) 溴酚蓝；DTT 临用前加。
(8) SDS 变性聚丙烯酰胺凝胶。
(9) 转移缓冲液：25 mmol/L Tris，192 mmol/L 甘氨酸，20% (V/V) 甲醇，4℃ 保存。
(10) 硝酸纤维素膜。
(11）电转移装。
(12) 银染试剂：2% (m/V) 柠檬酸钠，0.8% (m/V) 硫酸亚铁，0.1% (m/V) 硝酸银，4℃ 保存。
二、操作方法
1. 全长含核苷酸类似物的 RNA 合成
(1) 100 μl 反应体系中加入终浓度为 100 nmoI/L 模板 DNA，100 nmol/L 大肠杆菌 RNA 聚合酶及缓冲液 A (或 T7 噬菌体聚合酶及缓冲液 F)，于 37℃ 孵育 5 min。
(2) 避光加入 100 μmol/L ATP，10 μmol/L UTP 或 CTP，20 μmol/L [ α-32P] GTP，150 μmol/L 5-APAS-UTP 或 5-APAS-CTP，以及加入浓度逐渐递增的 UTP 或 CTP ( 0 μmol/L，1 μmol/L，5 μmol/L，10 μmol/L，20 μmol/L 孵育 5 min。
(3) 加 1 μl 肝素，于 37℃ 孵育 10 min。
(4) 加入RQ1 无 RNase 的 DNase I (5U) ，于 37℃ 孵育 10 min。
(5) 加入 100 mmol/L MgCl2，20 μg 无 RNase 的 tRNA。
(6) 加入等体积 (100 μl ) 酚：氯仿：异戊醇（25 : 24 : 1) ，振荡混匀，14000 g 离心 5 min。
(7) 取上层水相至一新离心管，加入 3 倍体积（300 μl ) 的含 1 mol/L NH4Ac 的乙醇，混匀，冰浴 10 min，14000 g 离心 5 min。
(8) 小心去除上清，以 100 μl 80% (V/V) 乙醇洗 RNA，14000 g 离心 5 min。
(9) 小心去除上清，晾干。
(10) 将 RNA 溶于 100 μl 去离子水或缓冲液中。
(11) 将反应产物等分，取一半加入一干净离心管，将管置于 UV ( 302 nm max) 光源 1.5 cm 处，室温照射 2 mm，另一半反应产物在照射过程中置于室温避光处。
(12) 加 100 mmol/L DTT 以还原残余叠氮化合物，避光反应至少 5 min（以后操作不必再避光）。
(13) 加入等体积 2X 缓冲液 C；于 95°C 孵育 2 min；冰浴冷却；7 mol/L 尿素/聚內烯 酰胺胶电泳（胶浓度及长度取决于待检测 RNA 的大小，RNA 大小与胶浓度有以下对应关系：大于 100 nt，6%；30~100 nt，5%；小于 30 nt，25%)。
(14) 在压片盒内依次铺上滤纸，胶，保鲜膜，X线片，增感屏；-80℃ 放射自显影过夜。
(15) 从放射自显影结果分析最适 UTP 或 CTP 浓度。
(16) 按方法“RNA 与蛋白交联”进行 RNA 蛋白质交联。
2. 分子表面掺入具光交联活性的核苷酸类似物的 RNA 合成
(1) 按方法“全长含核苷酸类似物的 RNA 合成”中的步骤（1）~（10）制备并纯化插入 5-SH-UTP 或 5-SH-CTP 的 RNA，调 pH 7.0。
(2) 避光环境加入 APB（溶解于二甲基砜），终浓度 5 mmol/L。
(3) 室温避光孵育 2 h。
(4) 制备 Sephadex G-50 柱：称取 7 g Scphadex G-50，加 100 ml 去离子水，悬浮液高压灭菌。将 1 ml 的 Sephadex G-50 悬浮液加入 1 ml 的柱内，3500 g 离心 3 min，重复上样至柱内凝胶体积达 750 μl。
(5) 以 200 μl 缓冲液 D 平衡柱，3500 g 离心 4 min，重复 3 次，弃洗脱液。
(6) 避光加入 200 μl 反应液 [ 凝胶与样本液之间的比例 ( 750：200 ) 十分关键 ]。
(7) 3000 g 离心 3 min。
(8) 收集流出液，按方法“RNA 与蛋白交联” 进行 RNA-蛋白质交联。
3. RNA 与蛋白交联
(1) 在 RNA-蛋白质交联中采用前面实验优化得到的最佳 UTP 和 CTP 浓度，重复方法1 中的步骤 (1)~(9)，用灭菌的去离子水或适宜的缓冲液 (根据相应的 RNA 或蛋白决定）重悬 RNA，加入适宜浓度的可能与 RNA 结合的蛋白。
(2) 将反应产物等分，取一半加入一干净离心管，将管置于 UV 光源 1.5 cm 处，室温 (有些结合需要特定的反应温度）照射 2 min，另一半反应产物在照射过程中置于室温避光处作为阴性对照。
(3) 加入 DTT 至终浓度 100 mmol/L，避光放置至少 5 min（此后步骤不必再避光）。
(4) 从未受照射的样本中取出少量样品用于鉴定所用 RNA 长度的正确性。[ 见方法“全长含核苷酸类似物的 RNA 合成”中，步骤 (13) ]。
(5) 余下样品加入等体积的 RNase T1 消化缓冲液及 10 U/μl RNase T1，于 37°C 孵育 10 min。
(6) 加入等体积的 2X 蛋白上样缓冲液，94°C 加热 2~3 min，变性 SDS-PAGE 电泳。
(7) 常规“三文治”法电转移：500 mA，2 h。
(8) 取膜银染至见到条带（约 5 min），空气下燥。
(9) X 射线片，-80°C 放射自显影至交联蛋白显现 ( 对交联效率低的蛋白可能需要数天）。
1. 全长含核苷酸类似物的 RNA 合成
所有的缓冲液配制均需采用经过蒸馏并灭菌的去离子水
(1) 缓冲液 A：20 mmol/L Tris-HAc ( pH 8.0 )，10 mmol/L Mg(Ac)2，50 mmol/L 谷氨酸钾。
(2) 5% (V/V) 甘油，40 mmoI/L Na2EDTA ( pH 8.0 )，40 μg/mL 乙酰化牛血清白蛋白，-20℃ 保存。
(3) 缓冲液 B：1.5 mol/L NH4Ac，37.5 mmol/L Na2EDTA( pH 8.0 )，50 μg/ml 无RNase 的 tRNA，20℃ 保存。
(4) 缓冲液 C (2X)：8 mol/L 尿素，0.1% (m/V) 二甲苯青，0.1% (m/V) 溴酚蓝。
(5) FPLC 纯化的核苷酸，ATP，CTP，GTP，UTP，-80°C 保存。
(6) 5-SH-UTP，5-SH-CTP，5-APAS-UTP 和 5-APAS-CTP 配制成 1~3 mol/L 的水溶液，-80℃ 避光保存。
(7) T7 噬菌体 RNA 聚合酶或大肠杆菌 RNA 聚合酶。
(8) [ α-32P ] GTP 的工作浓度范围为 105 cpm/pmol~107 cpm/pmol。
(9) 1 mol/L NH4Ac 以无水乙醇配制，室温保存。
(10) 肝素：0.5 mg/ml 水溶液，-20°C 保存。
(11) 缓冲液 F：40 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.6)，15 mmol/L MgCl2，10 mmol/L β-巯基乙醇，乙酰化牛血淸白蛋白。
(12) 酚：氯仿：异戊醇（25：24：1 )。
(13) 80% (V/V) 乙醇。
(14) RQ1 无 RNase 的 DNase I ( Promega 公司）。
(15) 紫外光源号：Spectroline model XX-15B，Spectroline 公司）。
(16) 1 ml 离心管。
2. 分子表面掺入具光交联活性的核苷酸类似物的 RNA 合成
(1) 100 mmol/L 叠氮苯酰溴（Azidophenacyl bromide，APB，Sigma 公司）溶于硫酸二甲酯。
(2) Sephadex G-50，DNA 级。
(3) 缓冲液 D：30 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.0 )，10 mmol/L KCl，0.5 mmol/L Na2EDTA ( pH 8.0 )。
3. RNA 与蛋白的交联
(1) 缓冲液 C（2X）：8 mol/L 尿素，0.1%（m/V）二甲苯青，0.1%（m/V）溴酚蓝。
(2) 10X TBE 缓冲液：0.89 moI/L Tris 碱，0.89 mol/L 硼酸，20 mmol/L EDTA，室温保存。
(3) X 射线片。
(4) 增感屏。
(5) RNase T1 消化缓冲液：25 mmol/L 柠檬酸钠，1 mmol/L Na2EDTA ( pH 8.0 )，-20°C 保存。
(6) RNase T1。
(7) 2X 蛋白上样缓冲液：60 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0 )，60 mmol/L DTT，3.4% (m/V) SDS，17% (V/V) 甘油， 0.02% (m/V) 溴酚蓝；DTT 临用前加。
(8) SDS 变性聚丙烯酰胺凝胶。
(9) 转移缓冲液：25 mmol/L Tris，192 mmol/L 甘氨酸，20% (V/V) 甲醇，4℃ 保存。
(10) 硝酸纤维素膜。
(11）电转移装。
(12) 银染试剂：2% (m/V) 柠檬酸钠，0.8% (m/V) 硫酸亚铁，0.1% (m/V) 硝酸银，4℃ 保存。
二、操作方法
1. 全长含核苷酸类似物的 RNA 合成
(1) 100 μl 反应体系中加入终浓度为 100 nmoI/L 模板 DNA，100 nmol/L 大肠杆菌 RNA 聚合酶及缓冲液 A (或 T7 噬菌体聚合酶及缓冲液 F)，于 37℃ 孵育 5 min。
(2) 避光加入 100 μmol/L ATP，10 μmol/L UTP 或 CTP，20 μmol/L [ α-32P] GTP，150 μmol/L 5-APAS-UTP 或 5-APAS-CTP，以及加入浓度逐渐递增的 UTP 或 CTP ( 0 μmol/L，1 μmol/L，5 μmol/L，10 μmol/L，20 μmol/L 孵育 5 min。
(3) 加 1 μl 肝素，于 37℃ 孵育 10 min。
(4) 加入RQ1 无 RNase 的 DNase I (5U) ，于 37℃ 孵育 10 min。
(5) 加入 100 mmol/L MgCl2，20 μg 无 RNase 的 tRNA。
(6) 加入等体积 (100 μl ) 酚：氯仿：异戊醇（25 : 24 : 1) ，振荡混匀，14000 g 离心 5 min。
(7) 取上层水相至一新离心管，加入 3 倍体积（300 μl ) 的含 1 mol/L NH4Ac 的乙醇，混匀，冰浴 10 min，14000 g 离心 5 min。
(8) 小心去除上清，以 100 μl 80% (V/V) 乙醇洗 RNA，14000 g 离心 5 min。
(9) 小心去除上清，晾干。
(10) 将 RNA 溶于 100 μl 去离子水或缓冲液中。
(11) 将反应产物等分，取一半加入一干净离心管，将管置于 UV ( 302 nm max) 光源 1.5 cm 处，室温照射 2 mm，另一半反应产物在照射过程中置于室温避光处。
(12) 加 100 mmol/L DTT 以还原残余叠氮化合物，避光反应至少 5 min（以后操作不必再避光）。
(13) 加入等体积 2X 缓冲液 C；于 95°C 孵育 2 min；冰浴冷却；7 mol/L 尿素/聚內烯 酰胺胶电泳（胶浓度及长度取决于待检测 RNA 的大小，RNA 大小与胶浓度有以下对应关系：大于 100 nt，6%；30~100 nt，5%；小于 30 nt，25%)。
(14) 在压片盒内依次铺上滤纸，胶，保鲜膜，X线片，增感屏；-80℃ 放射自显影过夜。
(15) 从放射自显影结果分析最适 UTP 或 CTP 浓度。
(16) 按方法“RNA 与蛋白交联”进行 RNA 蛋白质交联。
2. 分子表面掺入具光交联活性的核苷酸类似物的 RNA 合成
(1) 按方法“全长含核苷酸类似物的 RNA 合成”中的步骤（1）~（10）制备并纯化插入 5-SH-UTP 或 5-SH-CTP 的 RNA，调 pH 7.0。
(2) 避光环境加入 APB（溶解于二甲基砜），终浓度 5 mmol/L。
(3) 室温避光孵育 2 h。
(4) 制备 Sephadex G-50 柱：称取 7 g Scphadex G-50，加 100 ml 去离子水，悬浮液高压灭菌。将 1 ml 的 Sephadex G-50 悬浮液加入 1 ml 的柱内，3500 g 离心 3 min，重复上样至柱内凝胶体积达 750 μl。
(5) 以 200 μl 缓冲液 D 平衡柱，3500 g 离心 4 min，重复 3 次，弃洗脱液。
(6) 避光加入 200 μl 反应液 [ 凝胶与样本液之间的比例 ( 750：200 ) 十分关键 ]。
(7) 3000 g 离心 3 min。
(8) 收集流出液，按方法“RNA 与蛋白交联” 进行 RNA-蛋白质交联。
3. RNA 与蛋白交联
(1) 在 RNA-蛋白质交联中采用前面实验优化得到的最佳 UTP 和 CTP 浓度，重复方法1 中的步骤 (1)~(9)，用灭菌的去离子水或适宜的缓冲液 (根据相应的 RNA 或蛋白决定）重悬 RNA，加入适宜浓度的可能与 RNA 结合的蛋白。
(2) 将反应产物等分，取一半加入一干净离心管，将管置于 UV 光源 1.5 cm 处，室温 (有些结合需要特定的反应温度）照射 2 min，另一半反应产物在照射过程中置于室温避光处作为阴性对照。
(3) 加入 DTT 至终浓度 100 mmol/L，避光放置至少 5 min（此后步骤不必再避光）。
(4) 从未受照射的样本中取出少量样品用于鉴定所用 RNA 长度的正确性。[ 见方法“全长含核苷酸类似物的 RNA 合成”中，步骤 (13) ]。
(5) 余下样品加入等体积的 RNase T1 消化缓冲液及 10 U/μl RNase T1，于 37°C 孵育 10 min。
(6) 加入等体积的 2X 蛋白上样缓冲液，94°C 加热 2~3 min，变性 SDS-PAGE 电泳。
(7) 常规“三文治”法电转移：500 mA，2 h。
(8) 取膜银染至见到条带（约 5 min），空气下燥。
(9) X 射线片，-80°C 放射自显影至交联蛋白显现 ( 对交联效率低的蛋白可能需要数天）。
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