方案 5.10 PAT 法分析mRNA Poly（A）尾长度
原理PAT法 [ PCR poly(A) test ] 可以快速、灵敏地从总 RNA 中分析特异 mRNA，而且可以定量估算 RNA poly(A) 尾长度。这
原理
PAT法 [ PCR poly(A) test ] 可以快速、灵敏地从总 RNA 中分析特异 mRNA，而且可以定量估算 RNA poly(A) 尾长度。这方法中，包括 cDNA 合成的整个操作过程都在一个反应管中完成，不仅操作更简便，也减少了可能存在的 RNase 污染。尤其是 PAT cDNA 合成后非常稳定，并可重复使用，该方法的易操作性及灵敏度使其可以在任何系统中分析 poly(A) 尾的长度，目前已成功应用于鼠卵母细胞、果蝇卵母细胞和肝胎、线虫、酵母及培养细胞中 poly(A) 的分析。
材料与仪器
T4 DNA连接酶 无 RNase H SuperscriptⅡ反转录酶 寡聚(dT)锚引物 mRNA特异引物
蒸馏水 Superscript Ⅱ RT缓冲液 DTT ATP dNTP Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶缓冲液
蒸馏水 Superscript Ⅱ RT缓冲液 DTT ATP dNTP Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶缓冲液
步骤
一、材料与设备
1. PAT cDNA 制备
(1) DEPC 处理蒸馏水。
(2) 高浓度T4 DNA 连接酶（10 Weiss U/L）。
(3) 无 RNase H Superscript Ⅱ 反转录酶（RT) ( Life Technologies，Gairhersburg，MD，USA ) ( 200 U/μl )。
(4) 5 X Superscript Ⅱ RT 缓冲液。
(5) 0.1 mol/L DTT，DEPC 水配制。
(6) 10 mmol/L ATP，DEPC 水配制。
(7) 40 mmoI/L dNTP ( 10 mmol/L dATP、10 mmol/L dTTP、10 mmol/L dCTP、10 mmol/L dGTP)，DEPO-H2O 配制。
(8) p[dT]12-18注意寡[dT]12-18必须被磷酸化 ]，10 ng/μl。
(9) 寡聚（dT ) 锚引物（5'-GCG AGC TCC GCG GCC GCG T12）200 ng/μl ( 也可以使用其他 3' 端具有寡聚 dT 延伸（n>10 ) 并且 5' 富含 GC 的寡核背酸作为 PCR 引物），DEPC 水配制，所有上述酶及溶液均保存于 -20℃ 。
2. PCR 反应
(1) 40 mmol/L dNTP ( 10 mmol/L dATP、10 mmol/L dTTP、10 mmol/L dCTP、10 mmol/L dGTP)，DEPC 水配制。
(2) 寡聚（dT ) 锚引物 200 ng/μl 水配制。
(3) mRNA 特异引物，溶于蒸馏水。
(4) Taq DNA 聚合酶。
(5) 10X Taq DNA 聚合酶缓冲液。
二、操作方法
1. PAT cDNA 制备
(1) 从组织或细胞中提取总 RNA 溶于 DEPC 水中，取 5 μl 加入无 RNase 的微量离心管中。
(2) 加入 2 μl (20 ng) p[dT]12-18 至每个 RNA 样品中，RNA 和 p[dT]12-18 的总体积为 7 μl。
(3) 加热到 65℃，变性 5~10 min。
(4) 立即将反应管置于 42°C 水浴中，注意动作要迅速，以避免 p[dT]12-18 与最未端 poly(A) 尾退火。
(5) 加入 13 μl 预热至 42°C 的 下列混合物，用吸头吹打混匀，置 42℃ 孵育 30 min。对于所有 PAT 反应，预先混合所有相同组分，对于每一个反应，应加入：4 μl 5X Superscript II RT 缓冲液，2 μl 0.1 mol/L DTT，1 μl 40 mmol/L dNTP 混合物，1 μl 10 mmol/L ATP， 4 μl DEPC 处理水，1 μl T4 DNA 连接酶 10 Weiss U/μl。
(6) 孵育后，反成物仍保温于 42℃ ，加入 1 μl (200 ng ) 寡聚（dT) 锚引物。混匀，快速离心，12℃ 孵育 2 h。
(7) 将反应管置于 42℃ 孵育 2min。
(8) 加入 1 μl 无 RNase H Superscript II 反转录酶，混匀，置于 42°C 孵育 1 h。
(9) 加热 20 min，使反转录酶和连接酶失活，PAT cDNA 可根据需要进行稀释。
2. PCR 反应
(1) 25~50 μl 标准反应体系包括：1X 缓冲液 [ 50 mmol/L KCl，10 mol/L Tris-HCl ( 25°C 时 pH 9.0 )，0.1% Triton X-100，1.5 mmol/L MgCl2 ]，0.2 mmol/L dNTP，0.5 μmol/L 模板特异引物，0.5 μmol/L 寡聚（dT) 锚引物，0.5~1.0 U Taq DMA 聚合酶， 0.5~1.0 μl PAT cDNA 作为模板。
(2) 扩增 500 bp 长片段建议使用的循环条件：93°C 变性 5 min，93°C 变件 30 s，57~65°C 复性 1 min，72℃ 延伸 1 min，最后 72°C 延伸 7 min。
(3) 可以取一小部分扩增产物，利用限制性内切核酸酶完全消化分析 3' 末端。
(4) 用凝胶电泳分析扩增产物。
1. PAT cDNA 制备
(1) DEPC 处理蒸馏水。
(2) 高浓度T4 DNA 连接酶（10 Weiss U/L）。
(3) 无 RNase H Superscript Ⅱ 反转录酶（RT) ( Life Technologies，Gairhersburg，MD，USA ) ( 200 U/μl )。
(4) 5 X Superscript Ⅱ RT 缓冲液。
(5) 0.1 mol/L DTT，DEPC 水配制。
(6) 10 mmol/L ATP，DEPC 水配制。
(7) 40 mmoI/L dNTP ( 10 mmol/L dATP、10 mmol/L dTTP、10 mmol/L dCTP、10 mmol/L dGTP)，DEPO-H2O 配制。
(8) p[dT]12-18注意寡[dT]12-18必须被磷酸化 ]，10 ng/μl。
(9) 寡聚（dT ) 锚引物（5'-GCG AGC TCC GCG GCC GCG T12）200 ng/μl ( 也可以使用其他 3' 端具有寡聚 dT 延伸（n>10 ) 并且 5' 富含 GC 的寡核背酸作为 PCR 引物），DEPC 水配制，所有上述酶及溶液均保存于 -20℃ 。
2. PCR 反应
(1) 40 mmol/L dNTP ( 10 mmol/L dATP、10 mmol/L dTTP、10 mmol/L dCTP、10 mmol/L dGTP)，DEPC 水配制。
(2) 寡聚（dT ) 锚引物 200 ng/μl 水配制。
(3) mRNA 特异引物，溶于蒸馏水。
(4) Taq DNA 聚合酶。
(5) 10X Taq DNA 聚合酶缓冲液。
二、操作方法
1. PAT cDNA 制备
(1) 从组织或细胞中提取总 RNA 溶于 DEPC 水中，取 5 μl 加入无 RNase 的微量离心管中。
(2) 加入 2 μl (20 ng) p[dT]12-18 至每个 RNA 样品中，RNA 和 p[dT]12-18 的总体积为 7 μl。
(3) 加热到 65℃，变性 5~10 min。
(4) 立即将反应管置于 42°C 水浴中，注意动作要迅速，以避免 p[dT]12-18 与最未端 poly(A) 尾退火。
(5) 加入 13 μl 预热至 42°C 的 下列混合物，用吸头吹打混匀，置 42℃ 孵育 30 min。对于所有 PAT 反应，预先混合所有相同组分，对于每一个反应，应加入：4 μl 5X Superscript II RT 缓冲液，2 μl 0.1 mol/L DTT，1 μl 40 mmol/L dNTP 混合物，1 μl 10 mmol/L ATP， 4 μl DEPC 处理水，1 μl T4 DNA 连接酶 10 Weiss U/μl。
(6) 孵育后，反成物仍保温于 42℃ ，加入 1 μl (200 ng ) 寡聚（dT) 锚引物。混匀，快速离心，12℃ 孵育 2 h。
(7) 将反应管置于 42℃ 孵育 2min。
(8) 加入 1 μl 无 RNase H Superscript II 反转录酶，混匀，置于 42°C 孵育 1 h。
(9) 加热 20 min，使反转录酶和连接酶失活，PAT cDNA 可根据需要进行稀释。
2. PCR 反应
(1) 25~50 μl 标准反应体系包括：1X 缓冲液 [ 50 mmol/L KCl，10 mol/L Tris-HCl ( 25°C 时 pH 9.0 )，0.1% Triton X-100，1.5 mmol/L MgCl2 ]，0.2 mmol/L dNTP，0.5 μmol/L 模板特异引物，0.5 μmol/L 寡聚（dT) 锚引物，0.5~1.0 U Taq DMA 聚合酶， 0.5~1.0 μl PAT cDNA 作为模板。
(2) 扩增 500 bp 长片段建议使用的循环条件：93°C 变性 5 min，93°C 变件 30 s，57~65°C 复性 1 min，72℃ 延伸 1 min，最后 72°C 延伸 7 min。
(3) 可以取一小部分扩增产物，利用限制性内切核酸酶完全消化分析 3' 末端。
(4) 用凝胶电泳分析扩增产物。
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