RNase A/Tl 保护和 RNase H 聚焦法实验（RNase H 聚焦法）
原理RNA与互补的 [ 32P ] 标记的探针在溶液中复件后形成的 RNA-RNA 杂合分子对单链专一的 RNase 具有抗性。此法可以对 RNA 分子末端进行
原理
RNA与互补的 [ 32P ] 标记的探针在溶液中复件后形成的 RNA-RNA 杂合分子对单链专一的 RNase 具有抗性。此法可以对 RNA 分子末端进行定位或对含内含子的交界定位。与 Northern blot 相比，它是一种十分有效而且灵敏度很高的并可用于测定 mRNA 丰度的方法。杂交过程中加入过量的探针能使所有互补序列形成标记的杂合分子。未杂交探引和已杂交探针的单链部分则被消化而清除。“被保护的”探针通过变性 的聚丙烯酰胺凝胶来检测并定量。最初是用 DNA 单链作为探针，但是单链 DNA 的制备耗时多。又因为标记 RNA非常容易，所以根据 RNA-RNA 杂交进行测定十分有利。
材料与仪器
RNase酶切混合物
工具酶 杂交缓冲液 加样终止缓冲液 TBE缓冲液 RNA探针
水浴 垂直电泳装置 电转移装置 杂交管 杂交炉 暗片盒 X射线片 尼龙膜
工具酶 杂交缓冲液 加样终止缓冲液 TBE缓冲液 RNA探针
水浴 垂直电泳装置 电转移装置 杂交管 杂交炉 暗片盒 X射线片 尼龙膜
步骤
一、材料与设备
1. 水浴。
2. 垂直电泳装置。
3. 电转移装置 。
4. 杂交管。
5. 杂交炉。
6. 暗片盒。
7. X 射线片。
8. 尼龙膜。
9. 工具酶：RNase A、RNase T1、RNase H 和蛋白酶 K。
10. 杂交缓冲液：40 mmol/L PIPES ( pH 6.4 )，1 mmol/L EDTA，0.4 mol/L NaCl，80% 甲酰胺。
11. RNase 酶切混合物：0.3 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4 )，5 mmol/L EDTA，90 U/ml RNase T1，40 μg/ml RNase A。
12. 加样终止缓冲液：20 mmol/L EDTA ( pH 8.0 )，95% 甲醜胺，0.5 mg/ml 二甲苯青 FF，0.5 mg/ml 溴酚蓝。
13. TBE 缓冲液：0.5 mol/L Tris-硼酸（pH 8.3 )，10 mmol/L EDTA。
14. [ 32P ] 标记的 RNA 探针。
二、操作方法
1. 按照引物延伸法将单链寡核苷酸 DNA 与靶 RNA 退火。
2. 制备下列混合物：退火反应物 15 μl，100 mmol/L MgCl2 2.25 μl，10 mmol/L DTT 4.5 μl，RNase H 1.5 μl（6U），加水至终体积为 45 μl。
3. 将混合物于 37℃ 1 h，加入 2 μl 0.5 mol/L EDTA 以终止反应，并于 37℃ 反应 10 min 以灭活 RNase H。
4. 加入 55 加人 55 μl TE，并用 1/20 体积 4.5 mol/L NaAc ( pH 6.0) 和 2.5 倍体积冷的 95% 乙醇于 -20 ℃ 过夜沉淀 RNA。
5. 以 12000 g 离心 15 min，4℃ 回收RNA，用70%乙醇洗涤沉淀，12000 g 离心 10 min，在旋转真空冷冻干燥器中干燥沉淀。RNase H 酶切的 RNA 片段既可用 RNA 作图中引物延伸中 5' 端标记的方法加以检测，也可用 Northern 印迹方法进行检测。
6. 用 3 μl H2O 重悬沉淀，加入 3 μl 加样终止缓冲液并迸行变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳。
7. 电泳结束，将凝胶浸入 0.5X TBE 缓冲液中 15 min。安置一个将 RNA 从凝胶转移至膜转移用的“滤纸一凝胶一尼龙膜”的“夹层”，确保在膜和凝胶之间没有产生气泡。
8. 将上述的“夹层”插入含有冷的 0.5X TBE 缓冲液的转移装置中，使膜置于凝胶和阳极之间。
9. 电印迹使 RNA 从凝胶转移至膜上。电印迹的条件将根据 RNA 分子大小和凝胶尺寸而变化。通常对于一个 14 cmX 18 cm 聚丙烯酰胺凝胶，小于 1000 nt 的 RNA，以 500 mA (U=65V) 印迹 3 h 即可发生完全的转移。
10. 在 0.5 X TBE 缓冲液中洗膜 5 min，并将膜晾干。
11. 在真空烘箱中于 80℃ 烤 2 h 或用 UV 交联机照射使 RNA 与膜发生交联，然后按照 Northern 印迹章节中所述的方法用适当的探针通过杂交检测 RNA 片段。
1. 水浴。
2. 垂直电泳装置。
3. 电转移装置 。
4. 杂交管。
5. 杂交炉。
6. 暗片盒。
7. X 射线片。
8. 尼龙膜。
9. 工具酶：RNase A、RNase T1、RNase H 和蛋白酶 K。
10. 杂交缓冲液：40 mmol/L PIPES ( pH 6.4 )，1 mmol/L EDTA，0.4 mol/L NaCl，80% 甲酰胺。
11. RNase 酶切混合物：0.3 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4 )，5 mmol/L EDTA，90 U/ml RNase T1，40 μg/ml RNase A。
12. 加样终止缓冲液：20 mmol/L EDTA ( pH 8.0 )，95% 甲醜胺，0.5 mg/ml 二甲苯青 FF，0.5 mg/ml 溴酚蓝。
13. TBE 缓冲液：0.5 mol/L Tris-硼酸（pH 8.3 )，10 mmol/L EDTA。
14. [ 32P ] 标记的 RNA 探针。
二、操作方法
1. 按照引物延伸法将单链寡核苷酸 DNA 与靶 RNA 退火。
2. 制备下列混合物：退火反应物 15 μl，100 mmol/L MgCl2 2.25 μl，10 mmol/L DTT 4.5 μl，RNase H 1.5 μl（6U），加水至终体积为 45 μl。
3. 将混合物于 37℃ 1 h，加入 2 μl 0.5 mol/L EDTA 以终止反应，并于 37℃ 反应 10 min 以灭活 RNase H。
4. 加入 55 加人 55 μl TE，并用 1/20 体积 4.5 mol/L NaAc ( pH 6.0) 和 2.5 倍体积冷的 95% 乙醇于 -20 ℃ 过夜沉淀 RNA。
5. 以 12000 g 离心 15 min，4℃ 回收RNA，用70%乙醇洗涤沉淀，12000 g 离心 10 min，在旋转真空冷冻干燥器中干燥沉淀。RNase H 酶切的 RNA 片段既可用 RNA 作图中引物延伸中 5' 端标记的方法加以检测，也可用 Northern 印迹方法进行检测。
6. 用 3 μl H2O 重悬沉淀，加入 3 μl 加样终止缓冲液并迸行变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳。
7. 电泳结束，将凝胶浸入 0.5X TBE 缓冲液中 15 min。安置一个将 RNA 从凝胶转移至膜转移用的“滤纸一凝胶一尼龙膜”的“夹层”，确保在膜和凝胶之间没有产生气泡。
8. 将上述的“夹层”插入含有冷的 0.5X TBE 缓冲液的转移装置中，使膜置于凝胶和阳极之间。
9. 电印迹使 RNA 从凝胶转移至膜上。电印迹的条件将根据 RNA 分子大小和凝胶尺寸而变化。通常对于一个 14 cmX 18 cm 聚丙烯酰胺凝胶，小于 1000 nt 的 RNA，以 500 mA (U=65V) 印迹 3 h 即可发生完全的转移。
10. 在 0.5 X TBE 缓冲液中洗膜 5 min，并将膜晾干。
11. 在真空烘箱中于 80℃ 烤 2 h 或用 UV 交联机照射使 RNA 与膜发生交联，然后按照 Northern 印迹章节中所述的方法用适当的探针通过杂交检测 RNA 片段。
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