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什么是流式细胞术？
流式细胞术是一种基于荧光的检测，从悬浮于溶液中的单个细胞就能同时测定多种特性，例如细胞群计数和蛋白丰度。它是一种强大的工具，可实现细胞特性的快速、定量和准确测定，并且提供针对细胞群异质性的卓越解读。 流式细胞术的应用 1、使用流式细胞术进行免疫表型分析 在细胞生物学中，流式细胞术的一种常见用途就是检测和定量样品中存在的细胞类型。由于不同的细胞类型在其表面上表达的蛋白不同，因此可实现细胞检测。 人外周血单核细胞 (PBMC) 可以使用免疫表型分析分为各种细胞类型。在此实验中，使用靶向细胞表面的 CD3、CD4 和 CD8 蛋白的抗体检测 T 细胞并进一步细分为 2 种主要亚群。CD3 是一种在所有 T 细胞中均表达的蛋白，它将 T 细胞与其他白细胞（中间、粉色细胞群）区分。一旦选择了 T 细胞，CD4+ 和 CD8+ 细胞群就很容易区分。该实验还使用了一种死活细胞鉴定染料，以便从分析中排除死细胞。 2、使用胞内流式细胞术进行信号转导研究 大多数关键生物过程都发生在细胞内。因此，虽然细胞表面上的蛋白可以用来检测细胞类型，但胞内蛋白的丰度和活性可驱动几乎所有的细胞过程。对胞内蛋白进行定量的能力可提供对细胞生物学的机制见解，并能发现疾病状态下的异常活动。 3、细胞分选 运用流式细胞术进行细胞分选，可以根据其物理或荧光特征进行细胞的分离和收集。细胞经过激光照射区之后，细胞分选仪可以生成含单个细胞的液滴。每个液滴被充电，然后利用电场使其偏转至各类收集管或多孔板中。这些富集的细胞可用于后续实验，例如组织培养或测序等。 流式细胞术的操作流程 1）细胞样品的制备：制备单悬液 2）封闭：用血清全IgG抗体或抗CD16和抗CD32单克隆抗体 3）荧光素偶联抗体标记 4）光电倍增管电压的设定 5）对照的设置 6）补偿调节 根据靶标抗体抗原表位确定细胞固定方案 1. 胞外蛋白 活细胞→封闭→一抗染色→荧光二抗染色→标记活性染料（封闭，染色在冰上或4℃）→数据收集 2. 胞内蛋白（包括免疫原设计在胞内测的膜蛋白） 固定/破膜→封闭→一抗染色→荧光二抗染色→数据收集 3. 需要胞外标记物共标的胞内蛋白检测 活细胞→封闭→标记CD marker→固定→胞内蛋白一抗染色→荧光二抗染色（洗涤孵育抗体时破膜）→数据收集 流式细胞术的3大要素 01 流式细胞仪 流式细胞术系统性地结合流体学、光学和电子系统，利用其荧光和物理特性检测各种微粒体。它是一种有效地从单细胞水平区分异质性细胞群体的技术。检测对象包括悬浮细胞、贴壁细胞或从实体组织分离的单细胞悬液。流式细胞术可用于细胞计数、细胞分选、荧光生物标志物的检测，从而能满足多参数细胞分析的需要。 流式细胞仪工作原理：单个细胞排队依次通过激光照射区，一系列光学探测器收集细胞的散射光和荧光信号 01 液流系统 液流系统可通过流体动力学聚焦或声波，使单细胞悬液形成规整的单细胞流。将样本注入流动室之后，被周围压力较高的鞘液流包裹，形成单细胞排列的液流。 02 光学系统 单细胞液流进入流动池的激光照射区，细胞发出的散射光信号和荧光信号分别由相应的探测器收集。 裂解红细胞后的全血散射光散点图 FSC反映细胞大小，而SSC反映细胞的颗粒度。如图所示，这些参数还可单独用于区分细胞的类型。综合运用FSC和SSC与荧光染色可以更深入了解样本细胞的特征。 数据展示 流式细胞术可分析大规模的细胞样本，并形成单细胞的数据点。该技术每秒可分析数以千计的细胞。数据可用单参数的直方图或双参数的散点图表示。直方图是单参数分析的典型代表，横轴通常是荧光信号，纵轴是相对细胞数量。直方图中出现不同的峰代表表达不同荧光水平的细胞群。双参数图可以同时分析两个参数，从而对样本进行更深入复杂的探究。双参数图可分为点状图、密度图或等高线图等。双参数点图可以根据两个指标的表达情况区分出很多细胞亚群。这些亚群还能通过“设门”进行进一步的分析。设门可将特定的细胞亚群区分出来，并仅对门内细胞的其它参数进行分析。
直方图显示相对荧光强度的细胞数量 从数据可以获得的信息：阳性和阴性细胞的比例荧光强度的平均值或中位值（MFI） 双参数图 双参数图（例如点图）可以用来区分表型。
补偿调节 荧光染料的发射光谱一般较为广泛，这可能导致光谱重叠，因此需要通过补偿对信号进行优化，为确保测定到的荧光信号由一 种荧光染料发出，需要从该荧光染料的信号中减去漏到该通道的其它染料的信号。为计算出补偿值，每次实验必须设置单色对照样本，测定出每种染料溢漏到其他通道的荧光信号，并通过调节补偿来减掉该溢漏的信号。补偿微球， 例如UltraCompeBeads™或者One CompeB -eads™，或实验中用到的抗体染色的细胞都可用作单色对照性染料。 更多流式微球信息，请访问 thermofisher.com/flow-controls 02 细胞样品 流式细胞术检测的对象一般是细胞，并且是呈独立状态的悬浮于液体中的细胞，如果要检测组织中的细胞，必须先将组织制备成单细胞悬液；如果培养细胞是贴壁细胞，需用先用胰酶消化细胞，然后收集待测样品细胞，离心、洗涤 免疫细胞通常需要接受特定的刺激才能活化，并增殖分化为成熟的细胞类型。活化的细胞通常会表达高水平的转录因子、细胞因子、趋化因子以及其他可通过流式细胞检测的调节因子。正确的活化试剂选择取决于细胞类型、目标蛋白的表达和动力学以及实验条件。 我们可以提供以下样品制备所需产品： 耗材/设备类： 试剂类： 03 荧光染料，荧光偶联抗体 荧光染料可以标记抗体或其他蛋白，样品细胞只有标记荧光素偶联抗体进而被激光照射后才能发射荧光信号，从而得到样品细胞表达某抗原分子强弱等情况。 根据以下几点来选择合适的荧光染料： • 流式细胞仪的激光和滤光器配置 • 目标蛋白的表达水平或丰度 • 荧光染料亮度 • 荧光激发发射光谱 Invitrogen Flow Cytometry Panel Builder是一款免费的在线工具www.thermofisher.com/order/panel-builder可帮助您选择适合的流式抗体和试剂，改善实验设计，更好地分离和检测单个目标细胞群。 eBioscience 高品质功能性抗体推荐产品 流式抗体涵盖： D标记物、转录因子、细胞因子、趋化因子和生长因子、信号通路标记物，包括磷酸化蛋白。
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