SDS-PAGE胶配制及注意事项

SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种基于大小分离蛋白质的常用技术。通过使蛋白质变性并赋予其均匀的负电荷，在电场作用下蛋白质向正极迁移，根据大小进行分离。本文将详细介绍SDS-PAGE凝胶的配制方法及常见问题和解决对策。

一、 SDS-PAGE凝胶配制
*注意事项：
丙烯酰胺和双丙烯酰胺是神经毒素，操作时应佩戴适当的个人防护装备。总体积通常为10 mL，但可以根据需要调整。
过硫酸铵（APS）作为引发剂，与TEMED一起使用可以加速聚合反应。
缓冲液的体积会根据丙烯酰胺和双丙烯酰胺的体积进行调整，以确保总体积的准确性。
这些配方是基于常用的分离胶浓度，具体实验可能需要根据目标蛋白质的分子量范围进行调整。

1. 分离胶配制
（1）配方表：
以下表格列出了不同浓度的分离胶的配方：

（2）配制步骤：
1. 清洁玻璃板和垫片：
• 使用去离子水和乙醇彻底清洁玻璃板和垫片，确保没有残留物。
2. 组装玻璃板：
• 使用垫片将玻璃板组装在稳定、均匀的表面上，确保组装紧锁夹子，检查玻璃板完好性。
3. 配制分离胶溶液：
• 在干燥、干净的烧杯中按照配方表中的比例混合水、30%丙烯酰胺、1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)、10% SDS、10% APS 和 TEMED。TEMED必须是最后 加入的成分。
• 搅拌均匀后，立即倒入组装好的玻璃板中，确保均匀分布。
• 用水或异丙醇覆盖凝胶表面，以保持均匀的表面，室温下凝固约 20-30 分钟。

2. 浓缩胶配制
（1）配方表：
以下表格列出了浓缩胶的配方：

（2）配制步骤：
1. 清洁玻璃板和垫片：
• 使用去离子水和乙醇彻底清洁玻璃板和垫片，确保没有残留物。
2. 组装玻璃板：
• 使用垫片将玻璃板组装在稳定、均匀的表面上，确保组装紧锁夹子，检查玻璃板完好性。
3. 配制浓缩胶溶液：
• 在干燥、干净的烧杯中按照配方表中的比例混合水、30%丙烯酰胺、0.5 M Tris-HCl (pH 6.8)、10% SDS、10% APS 和 TEMED。TEMED必须是最 后加入的成分。
• 搅拌均匀后，立即倒入组装好的玻璃板中，确保均匀分布。
• 用水或异丙醇覆盖凝胶表面，以保持均匀的表面，室温下凝固约 20-30 分钟。

二、 可能出现的问题及解决方案
在SDS-PAGE凝胶制备过程中，可能会遇到各种问题。以下是一些常见问题及其解决方案：

1. 漏胶问题：
• 原因：玻璃板未对齐或缺损，垫片密闭性不良。
• 解决方案：确保玻璃板干燥，对齐后紧锁夹子，检查玻璃板完好性。

2. 凝胶不凝固：
• 原因：APS或TEMED失效，操作不当。
• 解决方案：使用新鲜APS，确保TEMED未变质，避免胶未凝固前晃动。

3. 凝胶凝固不均匀：
• 原因：玻璃板未洗净，试剂有沉淀，混合不均匀。
• 解决方案：彻底清洗玻璃板，确保试剂澄清透明，均匀混合组分。

4. 凝胶中有气泡：
• 原因：胶垫材质问题，插梳子不当。
• 解决方案：使用实心软胶垫或保鲜膜，正确插入梳子。

5. 上层胶边缘缺损：
• 原因：玻璃板边条密闭性不良。
• 解决方案：检查并更换边条，确保其密闭性。

6. 拔梳子后泳道有胶丝：
• 原因：TEMED 用量过多。
• 解决方案：减少TEMED用量，确保在插梳子前胶未部分凝固。

7. 拔梳子后泳道歪斜：
• 原因：梳子与玻璃板不匹配。
• 解决方案：确保梳子与玻璃板匹配，必要时更换。

8. 上层胶中电泳出现“漏样”：
• 原因：玻璃板与胶局部分离，上样缓冲液问题。
• 解决方案：小心取下玻璃板，避免分离，上样时避免枪头插得太深。

9. 泳道中心凹陷：
• 原因：梳子插入后胶暴露于空气中时间过长。
• 解决方案：尽量在 25 分钟内插入梳子，避免长时间暴露。

结语
通过详细了解SDS-PAGE凝胶的配制方法及常见问题的解决方案，实验者可以有效提高实验成功率，减少误操作，从而获得高质量的实验结果。一块优质的SDS-PAGE胶能打好蛋白质电泳的基础，从而跑出清晰好看的条带，获得优质的实验结果。