Oasis HLB净化和ACQUITY UPLC/TQD快速分析动物性食品中糖皮质类激素兴奋剂的含量

概要：

本文应用沃特世（Waters®）Oasis®HLB固相提取技术和ACQUITY UPLC® 超高效液相色谱/TQD串联四极杆质谱系统测定分析动物性食品中糖皮质类激素兴奋剂。

前言

糖皮质激素（Glucocorticoids）的化学结构属于类固醇类化合物，具有调节糖代谢，促进蛋白转化为糖，提升血糖浓度，抗炎症、抗过敏作用，调节水盐代谢等作用。从体外大量摄入糖皮质类激素会造成体内激素比例失调，糖代谢和无机盐代谢紊乱；

长期大量使用糖皮质类激素还会诱发或加重感染，出现心血管系统并发症、骨质疏松、肌肉萎缩、伤口愈合迟缓以及出现消化系统并发症，例如使胃酸、胃蛋白酶分泌增加，抑制胃粘液分泌，降低胃肠粘膜的抵抗力，甚至造成消化道出血或穿孔。

糖皮质类激素对人体健康除了具有很多副作用外，也会影响运动员参加比赛时的身体状态，违背了体育比赛公平竞争的原则，所以此类药物属于国际奥委会宣布禁用合成类固醇类兴奋剂。

近年来在一些供运动动员食用的保健类食品、营养补充剂及部分动物性食品中检出含有糖皮质类激素类的事件屡有发生，由于误食此类被污染的食品，使很多运动员出现不必要的阳性结果。

2008年北京奥运会除对参赛运动员进行严格的兴奋剂检测外，同样要对供运动员食用的各类食品进行严格的监测。本文采用沃特世HLB固相提取净化技术和UPLC?/TQD系统建立动物性食品中糖皮质类激素的快速、高通量筛查及确证技术，为此类食品的兴奋剂监测提供了全方案的技术支持。

实验方法

1.1 试剂和材料

20孔真空提取装置，旋转蒸发仪，Oasis HLB（500mg，6cc）：乙腈，甲醇，甲酸，乙酸乙酯均为色谱纯，实验用水为超纯水，无水硫酸钠。糖皮质类激素标准品：泼尼松，泼尼松龙，氢化可的松，可的松，甲基泼尼松，倍他米松，地塞米松，倍氯米松，氟氢可的松，纯度≥98%。

2.1 分析条件

液相色谱条件

LC系统：沃特世ACQUITY UPLC

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18，2.1mm×50mm，1.7μm

柱温：30℃

流速： 500μL/min

流动相A：水

流动相B：乙腈

梯度： 时间0 min 20%B

时间5 min 25%B

时间5.3 min 50%B

时间5.5 min 60%B

时间5.6 min 20%B

时间6.5 min 20%B

总分析时间6.5 min

进样量：10 μL

质谱条件

质谱系统：沃特世ACQUITY? TQD检测器

电离模式：ESI(-)

毛细管电压：2.8 kV

去溶剂气温度：400℃

去溶剂流速：800 L/h

离子源温度：130℃

数据采集：多反应监测（MRM）

碰撞气体： 氩气3.2×10-3 mba

调节ACQUITY TQD使得母离子和子离子在半峰宽的分辨率为0.7 Da以内。 本实验的多反应监测(MRM)、驻留时间、锥孔电压和碰撞能量列表参见表1。标注下划线的离子对用于定量分析。

数据采集和处理方法

沃特世公司Mass Lyn x®4.1操作软件用于数据采集，TargetLynx®应用管理软件用于数据处理。

3.1 样品前处理

称取5g的处理均匀的猪肉样品，依次加入10g无水硫酸钠，20mL乙酸乙酯，混合均匀后均质1min，振荡提取10min，在10000 转/min下离心5min。上清液转移至浓缩瓶中，再向残渣中加入10mL乙酸乙酯重复上述操作一次，合并两次提取液，在40℃下旋转蒸发至干。

浓缩后样品用5mL 30%甲醇水溶液溶解。Oasis HLB预先依次用3mL甲醇，6mL水活化。将上述提取液全部通过柱，依次用5 mL水，5mL 50%甲醇水溶液淋洗后抽干。用10mL甲醇/乙腈（1: 1）洗脱并接收，洗脱液在40℃下氮气吹干后，用乙腈/水（2: 8）溶解定容至1mL，过0.2μm滤膜后上机分析测定。