从环境基因组扩增脂肪酶片段的一些问题
问:简并引物的简并度并没有超过512,但是PCR时总是不能得到特异的带,只是在预定的位置出现一片弥散的带。后来提高模板浓度,并将退火温度从 50℃ 提高至65℃
问:简并引物的简并度并没有超过512,但是PCR时总是不能得到特异的带,只是在预定的位置出现一片弥散的带。后来提高模板浓度,并将退火温度从 50℃ 提高至65℃,做单引物对照即只加一条引物时能扩增出特异的带,而正常PCR却什么也扩增不出来,偶尔能扩增出一些片断也跟单引物对照的是一样的。并且重复性不好,有时能扩增出来有时什么都没有。确定模板没有问题,因为16S能扩增出来。请各位支招,感激不尽!
答:可以尝试锚定PCR!也可以用touch-down PCR方法,很多可能条件摸索不好!不知道你所沿环境基因组是什么意思?如果生物个体上,可能存在组织特异性,提取不同组织试探!