RNA免疫沉淀常见问题解答

1. miRNA是什么？具有什么作用？

答：microRNAs（miRNA）是一种内源性非编码小分子RNA，一般具有18到25个核苷酸，其序列在进化上高度保守，通过靶向特定mRNA来调节基因的表达。

miRNA是越来越受关注的转录后调控网络（post-transcriptional control）中重要的调控因子。首先，miRNA结合到核糖核蛋白（Ribonucleoprotein，RNP）复合物中，形成RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex, RISC），然后通过不完全的碱基互补靶向到目标mRNA的3’UTR区，再通过引导酶切影响了mRNA的稳定性，或直接阻碍翻译过程，从而介导特异mRNA靶标的转录后基因沉默。

2. RIP技术是什么？

答：RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀），是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助我们发现miRNA的调节靶点。RIP这种新兴的技术运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析。

3. RIP技术与ChIP技术有什么区别？

答：RIP可以看成是普遍使用的染色质免疫沉淀ChIP技术的类似应用，但由于研究对象是RNA-蛋白复合物而不是DNA-蛋白复合物，RIP实验的优化条件与ChIP实验不太相同（如复合物不需要固定，RIP反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有RNA酶，抗体需经RIP实验验证等等）。

4. RIP试验基本原理

答： （1）用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白。

（2）防止非特异性的RNA的结合。

（3）免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来。

（4）结合的RNA序列通过microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或 高通量测序（RIP-Seq）方法来鉴定。

5. RIP试验需要注意什么？

答：

（1）防止RNA与蛋白非特异性结合。

（2）避免RNA蛋白质结合被破坏。

（3）避免外源RNase污染。

（4）抑制内源RNase的活性。

（5）选择适合做RIP的抗体。

（6）避免RNA结合蛋白的降解。

6. 为什么抗体无法沉淀RIP裂解液中的目标蛋白？

答： （1）先进行IP或者WB，测试抗体可以与目标RBP结合。

（2）另选一个能与抗原其他表位结合的抗体。

（3）尽可能选用密理博RIPAb+抗体。

（4）稀释抗体成浓度梯度，进行IP测试。

（5）4℃过夜孵育抗体与RIP裂解液。

（6）确定抗体类型与Protein A/Protein G匹配。

7. 提取RNA时，蛋白酶K消化不完全是什么原因？

答：当进行蛋白酶K消化时，确保水浴温度应设置在55℃左右，长期在65℃以上孵育会导致蛋白酶K失活。

8. 提取RNA后，A260/A280比值偏离1.8~2.2区域是什么原因？

答： （1）需要缩短酚氯仿提取RNA的时间间隔。

（2）测试提纯后RNA中是否存在RNA酶，可能RNA发生了降解。

9. 做RIP的时候和beads孵育的lysate的浓度如何确定？有些动物的文献提到用细胞板数细胞个数，想知道如果用蛋白浓度的话，大概在什么数量范围的蛋白总量对应50 ul BEADS?

答：50 ul beads对应的是一个reaction，而我们推荐一个reaction是100ul裂解上清（2×107 cells加入100ul RIP lysis buffer得到），所以只需要在裂解前计数一下，并按括号中的比例加入裂解buffer，后续100 ul 裂解上清就是一个reaction的蛋白用量。不建议通过裂解后测蛋白浓度的方法进行配比。

10. RIP可以分提核浆的RNA-蛋白质复合物吗？

答：理论上，可以采用能分别抽提核浆蛋白的蛋白抽提kit先分离样本，再进行RIP实验。但需要特别注意的是所用kit中的reagent不能有RNase和DNase，以及要能与下游的抗体beads孵育兼容。