非同位素原位杂交组化与免疫组化联合法实验步骤
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步骤如下:
(1)将切片漂浮于能经受高压灭菌的器皿中。0.1mol/l PBS pH7.2冲洗3×5min。 (2)0.1mol/L甘氨酸PBS 冲洗5min。 (3)0.4% Triton X-100 PBS 15min。 (4)1μg./ml蛋白酶K(0.1mol/l Tris –HCl pH8.0, 50mmol/L EDTA 配),37℃保温30min。 (5)4%多聚甲醛PBS 5min。 (6)PBS冲洗2×min。 (7)0.25%乙酸酐(0.1mol/L三乙醇胺配)10min。 (8)2×SSC冲洗10min。 (9)将切片用灭菌吸水纸吸干,然后入杂交液。核酸探针浓度为0.25~0.5μg./ml。每一正常成年大鼠脑冠状切片15μl杂交液足够。43℃保温12~16h。 (10)4×SSc 37℃冲洗30min。 (11)2×SSC(含RNasea 20μg/ml)37℃保温30min。 (12)1×SSC和0.5×SSc 37℃分别冲洗30min。 (13)0.05mol/l PBS冲洗3×5min。 (14)0.5%H2O2 PBS室温20min。 (15)0.05mol/l PBS 冲洗2×5min。 (16)碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体(Fab)与抗蛋白或多肽等抗体混合液,前者一般1:1000稀释,后者则因抗体而异。稀释液:1%BSA,0.4%Triton X-100 ,0.05mol/L PBS pH7.2,4℃孵育24h。 (17)0.05mol/l PBS冲洗4×5min。 (18)二抗(1:100~1:200)37℃保温1h。 (19)0.05mol/l PBS冲洗3×5min。 (20)PAP(1:200~1:400)37℃保温1h。 (21)0.05mol/l PBS冲洗3×5min。 (22)DAB显色液(0.05%DAB + 0.03% H2O2,0.05mol/L PBS pH7.2配)显色5~10min。 (23)0.05mol/l PBS冲洗3×5min。 (24)TSM,冲洗2×5min(TSM1:0.1mol/l Tris – HCl pH8.0,0.1mol/L NaCl,0.01mol/L MgCl2). (25)硝基四氮唑蓝(400μg/ml)和5-溴-4-3-吲哚磷酸(200μg/ml)混合液(TSM2配显色混合液)显色1~3h,避光。 (26)20mmol/l EDTA终止显色。 (27)将切片贴于涂有铬矾明胶的载片上,空气干燥。 (28)梯度酒精脱水,透明、封片。