HER2显色原位杂交法

一、预处理

1. 脱蜡至水

（1）二甲苯5分钟，2次

（2）100%酒精1分钟，2次

（3）95%酒精1分钟，1次

（4）85%酒精1分钟，1次

（5）双蒸水1分钟，3次

2. 加热预处理

（1）热预处理液（试剂盒内带）加热至98-100℃时，放入切片，15-20分钟。

（2）双蒸水洗1分钟，3次

3. 胃蛋白酶消化

（1）将胃蛋白酶先放入37℃温箱预热，然后滴加至组织上。

（2）室温，5-30分钟（其间用显微镜观察，如果出现细胞核向外突出，有荷包蛋样改变即可停止，此步较为关键，消化不足和消化过了，都会导致假阴性或只有少量阳性）

（3）双蒸水1分钟，3次

4. 酒精脱水

（1）85%酒精1分钟，2次

（2）95%酒精1分钟，1次

（3）100%酒精1分钟，1次

（4）室温或37℃温箱干燥5分钟

二、变性和杂交

1. 滴加探针：在组织中央滴加探针（约法10-15 μl），将盖玻片轻轻的盖在组织上，避免产生气泡。

2. 将玻片放在原位杂交仪或原位PCR仪上，如没有也可平放于铝制饭盒等底平的器皿底部。

3. 95℃变性5分钟，如没有原位杂交仪或原位PCR仪，可将水烧开，拔去插座，放入铝盒，将水温控制在95℃-98℃，6分钟；也 可以放入95℃烤箱内，5分钟。

4. 快速冷却至37℃（如没有原位杂交仪或原位PCR仪，可将铝盒移至冰水中冷却），并将玻片移至湿盒内，37℃温箱孵育12小时。

5. 杂交后，小心除去玻片，放入CAS-BlockTM阻断液或TBS/Tween20（0.025%）液内洗1分钟，然后放入75℃的CAS-BlockTM阻断液洗5分钟，TBS/Tween20（0.025%）液洗也可达到同样的效果。

6. 双蒸水1分钟，3次

三、免疫显色

1. 滴加3%甲醇双氧水液5-10分钟（室温）。

2. TBS/Tween20（0.025%）液1分钟，3次。

3. 滴加封闭液5-10分钟（室温）。

4. 擦去多余封闭液，滴加小鼠抗地高辛抗体室温30分钟。

5. TBS/Tween20（0.025%）液1分钟，3次。

6. 滴加HRP-抗鼠抗体室温30分钟。

7. TBS/Tween20（0.025%）液1分钟，3次。

8. DAB显色5-30分钟（镜下控制，以组织芯片同时达到预期强度为标准）。

9. 自来水洗。

四、衬染和封片

1. 苏木素浅染10-30秒

2. 水洗，蓝化，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。