骨髓基质干细胞的应用

骨髓基质干细胞的应用研究表明，骨髓内含有多种干细胞，其中骨髓源的间充质干细胞又被称为骨髓基质干细胞(bone marrow stem cell，BMSC)。各国学者对动物来源的BMSC进行了大量的研究，结果证实可以在体内外定向分化为软骨细胞、成骨细胞及脂肪细胞等多种中胚层来源的细胞。BMSC是目前组织工程种子细胞研究的焦点。作为组织工程种子细胞具有以下优点：取材操作相对简单，对机体损伤小；抽取骨髓后，机体可自行修复、补充相应的细胞成分，因而可重复取材；培养体系成熟，便于推广应用；体外诱导技术基本成熟，容易达到预期结果。因此，在一定程度上可以说是一种理想的种子细胞。通过微创取材，得到少量的种子细胞，在体外大量扩增，然后用于新组织的构建，从而实现无创或微创愈合的完美的外科治疗效果。目前，国内外对BMSC的研究已较为深入，大量文献报道了其成功向软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞诱导的现象及应用于组织缺损修复，甚至初步应用于临床。1．成软骨诱导BMSC向软骨细胞的诱导分化的相关研究很多，目前较肯定的诱导因子主要有：TGF-β(transforminggrowthfactor-β，TGF-β)1、2、3，骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)2、6、9、13，胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)，软骨源性发生蛋白cartilage-derived morphogenetic protein，CDMP)1、2及地塞米松等。TGF-β主要作用于诱导的早期阶段，一般认为通过其受体激活Smad传导通路而启动软骨特异性基因的转录，主要是上调Ⅱ型胶原的表达与合成。BMP2、6等则可明显增强聚集蛋白聚糖(aggrecan)的表达与合成。IGF-l能明显提高上述两类因子的效能，增强它们的诱导作用，并能维持诱导后细胞的软骨表型与功能。CDMP是软骨分化早期的一类诱导因子，在胚胎肢体形成与软骨发育方面具有重要作用，可促进未分化的间充质细胞向软骨细胞分化。地塞米松是一种多效能的诱导因子，它能促进向软骨细胞、成骨细胞及脂肪细胞等多种方向的分化。此外，一些有利于软骨细胞保持分化状态的因素也具有不同程度的诱导作用，如低氧浓度、低血清浓度或无血清培养及高密度聚集培养等。但目前大多数研究仅限于在体外成软骨诱导分化，体内实验多数在关节内进行，这可能与诱导的在体内异位(如皮下)成软骨能力较低有关。研究表明，TGF-p1与地塞米松诱导后，BMSC可大量表达软骨细胞特异性的细胞外基质成分，但与聚环氧乙丙烯(pluronic)混合后，注射到裸鼠或猪自体皮下均不能形成成熟软骨组织，而是形成血管化明显的纤维样组织；但是将其注射到关节内环境中，则能形成成熟软骨组织，甚至修复关节软骨全层缺损。这说明关节内微环境有利于BMSC向软骨细胞分化。总之，尽管BMSC向软骨细胞分化的机制尚未完全明了，但研究人员已经掌握了其向软骨细胞诱导分化的成熟方法，因此，未来广泛应用于临床的可能性大大增加。 2．成骨诱导BMSC体外培养中不但能分化为骨、软骨等多种细胞，而且在体外长期传代后仍能保持其成骨潜能。在BMSC的多向分化潜能中，其成骨能力表现得尤为明显。在体外培养时向培养液中加入p-磷酸甘油、地塞米松及维生素D：等骨诱导成分后，BMSC便逐渐表现出成骨细胞的表型：细胞呈梭状，能自发地形成钙盐沉积，形成特征型的钙结节，肉眼观察可见培养皿底部形成多个结节样结构。多种组织学染色方法可证明钙结节的存在：茜素红染色(ARSstain)形成红色的结节，vonKossa染色形成黑色的结节。BMSC经成骨诱导后7天即可表现出碱性磷酸酶的显著增加。各种成骨特异性蛋白，如骨钙蛋白(osteocalcin，OCN)、骨桥蛋白(osteopontin，0PN)以及骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)等，也陆续开始表达。 3．BMSC修复关节软骨缺损软骨缺损是创伤治疗领域的一大难题。由外伤、肿瘤或软骨退行性病变所引起的关节软骨缺损，在临床上尚无有效的修复方法，最终将导致关节功能丧失，甚至残废，给患者带来严重的身心痛苦。人工关节置换术目前虽颇为盛行，但其有限的使用寿命及在体内可能引发的假体松动、毒性等一系列问题尚未得到妥善解决，尤其不适合年轻患者。因此，寻求一种生物性表面重建(biological resurfacing)方法，以便从根本上解决这一难题，成为临床的迫切需求。半个多世纪以来，人们先后研究了软骨移植、软骨膜移植、骨膜移植等多种修复方式，但大多形成以纤维软骨组织为主的假性修复，并伴随远期退化，根本无法满足临床要求。体外软骨细胞培养的成功，使得人们尝试直接以软骨细胞修复关节软骨缺损。将软骨细胞悬液注射到关节软骨缺损部位，结果表明，缺损为纤维组织修复，镜下仅见少量新生软骨细胞结节。BMSC同时具有成软骨与成骨潜能，理论上应是修复关节软骨与骨复合缺损的最佳种子细胞。在关节负重部位制造大面积全层关节面缺损，然后取自体的BMSC经体外大量扩增、成软骨诱导后，与可吸收支架材料聚乙醇酸复合后，用于修复关节缺损。研究结果表明，缺损不仅得到了良好的修复，而且其修复质量甚至超过了以自体软骨细胞为种子细胞的修复，表现为软骨缺损为组织工程化软骨组织修复，而深部的骨缺损则为组织工程化骨组织修复。因此，BMSC不但能在体外形成软骨、骨组织，还能在体内原位修复组织缺损。 4．BMSC在临床的初步应用各种外伤和脑外科术后造成的颅骨缺损是临床常见疾病，当缺损面积大于颅骨面积的1/10后，即不能通过周围骨组织再生修复缺损。目前常用的治疗方法如自体骨移植、异体骨移植及各种材料修复均存在不同程度的缺陷，并导致多种并发症。以BMSC为种子细胞，与可降解材料复合后回植到体内，随着材料的逐步降解，细胞分泌细胞外基质，最终形成具有生理功能的骨组织，有望成为一种骨缺损修复的全新治疗模式。以天然可吸收材料(如部分脱钙骨)为支架，利用经体外成骨诱导的自体hBMSC为种子细胞，进行组织工程技术修复人颅骨缺损的研究目前已在国内成功开展。通过三维CT及多项检测技术，可检测组织工程骨在人体内的形成过程及组织工程骨的结构和生物化学组成。三维CT结果显示：骨缺损区被填充，术后3～6个月，三维CT示置人的细胞材料复合物形成高密度影，提示组织工程骨形成并修复骨缺损区。术后6～48个月，三维CT示形成的组织工程骨稳定存在，且未观察到明显骨吸收现象，CT平扫可见组织工程骨和邻近骨存在融合现象。组织学检测结果显示形成的组织工程化骨的外围为正常骨小梁样结构，并可见软骨陷窝，说明这是典型的软骨内化骨过程。免疫组织化学检测显示，新生组织也表达骨桥蛋白和骨粘连蛋白等骨组织特异性蛋白质。组织工程骨在颅骨缺损修复中的应用结果已体现出其明显优势：从少量骨髓中分离hBMSC，经体外大规模扩增后修复大块骨缺损，改变目前骨缺损治疗中供区骨来源不足的问题，避免对自体骨供区的进一步损伤；经最长2年的随访，形成的组织工程骨稳定，生理功能正常。与传统自体骨移植治疗方法相比，组织工程技术修复缺损可不受缺损面积的限制，不造成供区的组织缺损和功能障碍，因此可达到无创修复大面积骨缺损的目的，易于被患者接受。