第5套丙型肝炎病毒抗体诊断试剂国家参考品的制定

一、目的

为促进我国丙型肝炎病毒抗体诊断试剂质量的进一步提高，研制了第5套丙型肝炎病毒抗体诊断试剂国家参考品。

二、材料与方法

1、样品来源

样品来自国内13省市，从几十万个供血员中进行筛选。选取初筛中可能为抗HCV阳性或ALT异常的样品，及A值在抗HCV EIA试剂临界值附近的弱阳性或高值阴性样品；用多种试剂对收集到的2000多份血样进行复检，从中选出317份进行HCV RNA、抗HCV抗体谱、HCV基因型等集中检测，每份样品的总体积在300 ml以上，保存于- 80℃。

2、试剂

美国Ortho HCV ELISA 3.0试剂；美国Murex HCV EIA 4.0 试剂； 意大利DiaSorin ETI-AB-HCVK-3 试剂；国内18 家有文号的抗-HCV EIA 试剂； 梅里埃HIV抗体试剂；上海荣盛公司HBsAg EIA 试剂；北京金豪公司TP抗体试剂；厦门新创公司HAV抗体酶联免疫试剂； CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA确证试剂；深圳匹基公司荧光HCV PCR试剂； CHIRON公司HCV RNA TMA试剂；上海瑞芯生物科技有限公司HCV基因分型试剂。

3、样品的复核及确证

对所选出的317份样品，用在中国注册的国外3种抗-HCV EIA 试剂及占国内抗-HCV 试剂市场50%以上的4种抗-HCV EIA试剂进行检测，同时对部分样品进抗-HIV、HBsAg、梅毒抗体和乙脑抗体等检测。

根据复检结果，对可能被挑选入参考品的样品用CHIRON公司抗-HCV RIBA确证试剂、HCV RNA PCR试剂、CHIRON公司HCV RNA TMA试剂进行了确证。利用HCV基因分型试剂对部分样品进行了HCV基因型别检测，并对部分分型结果用核苷酸序列测定的方法进一步确证。

4、会同标定

根据样品复检及确证结果，从317份样品中选出100份，邀请了国内外21家生产单位及实验室进行了会同标定。

盲样分装及下发后，要求各单位用当时试剂对样品进行检测。收到反馈的结果后，立即将本室的检测结果告之参加会同标定的单位，并要求各单位对本室的检测结果进行复核，或对本单位的试剂进行改进。

根据样品确证、复核及会同标定结果，考虑到样品的抗体谱、基因型别、地域代表性，尤其是国内试剂存在的问题，从中选出65份样品组成了第5套丙型肝炎病毒抗体诊断试剂国家参考品。

三、结果

1、样品的复核及确证

用3种国外抗-HCV E IA试剂，检测第5套HCV抗体试剂国家参考品中的30 份阳性样品，除1 种抗-HCV EIA 试剂出现1 份漏检外， 其它两种抗-HCV EIA试剂检测结果均为阳性。

用CHIRON R IBA HCV 3. 0 SIA确证试剂检测30份阳性样品，发现该30份样品涵盖了各种抗-HCV抗体及各种抗-HCV抗体谱组合，包括抗-HCV强阳性样品、中等强度和弱阳性样品。有的样品同时含有抗-HCV 核心、NS3、NS4和NS5 抗体，有的样品含有其中2 种或3种抗体组合，也有的样品只含有某一种抗体。

含有HCV核心抗体的样品有23份(其中单独阳性样品1份) ，含有NS3抗体的样品有29份(其中单独阳性样品7份) ，含有NS4抗体的样品有14份，含有NS5抗体的样品有9份。3份(L1、L2、L3)灵敏度参考品及1份精密度参考品(J)均同时含有抗-HCV核心、NS3、NS4和NS5抗体。

对30 份阳性样品进行了HCV 基因分型及HCV RNA检测。阳性样品包括了我国流行的主要HCV基因型1b、2a,还包括1a /1b、6a、3b.灵敏度参考品L1、L2、L3号为我国流行的主要HCV 基因型1b亚型。

精密度参考品(J)为1b /2a亚型，检测结果见表1.需要说明的是，基因型别检测方法是依赖于首先对HCV基因进行PCR扩增，然后才可检测，若样品中HCV RNA为阴性或含量太低，则无法进行分型，所以部分样品未显示HCV基因分型结果。

灵敏度样品L4为5份阴性血浆混合液，L1～L3为用L4稀释不同倍数的同1份抗-HCV阳性血浆；L1、L2均可被3种国外抗-HCV EIA试剂检出阳性，L3可被1种国外抗-HCV试剂检出阳性，另外两种试剂检测为阴性。3种国外抗-HCV EIA试剂检测L4均为阴性。

精密度样品为1份中等偏弱阳性血浆。用3种国外抗-HCV E IA试剂分别检测30份阴性样品，结果均为阴性。用CHIRON RIBA HCV 3.0SIA确证试剂及HCV RNA PCR试剂检测30份阴性样品，结果也均为阴性。

考虑到该套参考品有可能用于联合检测的试剂检定，对参考品中的65份样品，分别用梅里埃抗-HIV试剂、荣盛公司HBsAg试剂、金豪公司抗-TP试剂、新创公司抗-HAV试剂进行了检测，结果证明该65份样品均不含有抗-HIV、抗-HAV、抗-TP抗体及HBsAg.

2、参考品组成及判断标准

第5套抗-HCV试剂国家参考品由65份样品组成: 30份阴性样品，编号为N1～N30; 30份阳性样品，编号为P1～P30; 1份精密度样品，编号为J; 4份灵敏度样品，编号为L1～L4.合格标准：阴性30 符合率≥29 /30，阳性30 符合率≥29 /30，灵敏度4份 L1阳性，L2阳性，L3阳性或阴性，L4阴性，精密度1份 CV ≤15% ( n = 10)。

3、参考品的初步应用

第5套抗-HCV 国家参考品自2004 年10 月1日起被国家有关部门批准正式使用，各生产单位针对自己产品存在的问题进行分析，重新优化了试剂的主要原材料和工艺流程，目前已有8家自愿申请批批检定，结果均通过了国家标准。

四、讨论

第5套抗2HCV试剂国家参考品具有以下特点:

1、样品来源具有地域代表性及基因型代表性。

2、阳性样品包括我国流行的主要HCV基因型1b、2a.还包括1a /1b、6a、1b /2a、3b等。

3、阳性样品力求涵盖各种抗-HCV抗体及各种抗-HCV抗体谱组合，含有抗-HCV 强阳性样品、中等强度样品和弱阳性样品。

4、阴性参考品均为市售抗-HCV EIA 试剂检测时A值略低于试剂临界值的高值阴性样品，以控制试剂的非特异性反应。其抗-HCV、抗-HIV、抗-TP抗体和HBsAg均为阴性。

5、灵敏度参考品L1、L2、L3号含有抗-HCV核心抗体、NS3抗体、NS4抗体和NS5抗体，为我国流行的主要HCV基因型1b亚型，L4为全阴性血清稀释液。

6、精密度参考品为1份中等偏弱的阳性样品，1b /2a亚型。含抗2HCV核心、NS3、NS4和NS5抗体。

该套参考品对抗-HCV诊断试剂的质量提出了基本的合格标准。在研制这套参考品的过程中，考察了国内抗-HCV试剂的现状。用3种进口和18种国产抗-HCV EIA试剂，检测第5套抗-HCV试剂国家参考品所包括的30份阴性和30份阳性样品。

3种进口抗-HCV EIA试剂检测30份阴性样品最多出现了1份假阳性。而18种国产抗-HCV EIA试剂中的4种出现了9份假阳性， 13种出现了4～8份假阳性，没有任何一种可达到阴性符合率29 /30的标准。

说明当时的国产试剂特异性与国外试剂差距较大。3种进口的抗-HCV EIA试剂对30份阳性样品检测时， 1种试剂漏检了1份，另2种均可检出。18种国产抗-HCV E IA 试剂漏检数在0 ～2 之间。表明当时的某些国产抗-HCV E IA试剂灵敏度与国外试剂仍有一定差距，但其幅度较特异性小 。