药用化学成分生物转化方法及技术

 将天然或合成的有机化合物加入到生长状态的生物体系或酶制剂中，在适宜的条件下进行一段时间的共培养之后，外加的化合物与生物体系的酶发生相互作用，从而产生结构改变，如羟基化、苷化、环氧化等，这一过程就是生物转化(biotransformation)，亦称生物催化(biocatalysis)。简而言之，生物转化是利用生物体系或酶制剂对外源性化合物(底物，substrate)进行结构修饰的生物化学过程，其本质为酶催化反应。 在天然产物的生物转化研究中，用于生物转化的生物体系一般为微生物、植物细胞或组织器官培养物，以及由之而来的纯酶或粗酶制剂。最近，海洋微藻和一些昆虫的幼虫也开始用于生物转化的研究中。从广义上讲，药物代谢(drug metabolism)也属于生物转化的范畴。在现今的报道中，利用植物培养体系和微生物进行生物转化最为常见，因此下面以这两个体系为例阐述生物转化的一般方法及技术。 1 转化体系的建立及培养 1.1 植物转化体系（以植物悬浮培养细胞为例） 1.1.1 愈伤组织的诱导与培养 将植物的离体组织（理论上任何组织均可，最好为健壮幼嫩的组织）经常规消毒后接种于适宜的固体培养基上，经一段时间后，外植体一般由切口开始长出愈伤组织，逐渐扩展到整个组织表面。把愈伤组织从外植体上剥离，转移到成分相同的新鲜培养基上继续培养，这个过程称为继代培养(subculture)。经过反复多次的继代之后，即可形成生长稳定的愈伤组织。 1.1.2 细胞悬浮培养 细胞悬浮培养是指在液体培养基中保持良好分散性的单细胞或小细胞团的培养。将松散的愈伤组织转移至液体培养基中，于摇床上经一段时间的液体振荡之后，可分散成均匀悬浮的单细胞或多个细胞聚集在一起的细胞团，即是细胞悬浮培养物。悬浮培养常采用水平振荡，摇床的转速一般为30-150 r·min -1 , 冲程2-3 cm，温度24-30℃为宜。培养瓶中一般盛占容积三分之一体积的液体培养基。用于悬浮培养的愈伤组织最好是易碎性的，在液体振荡条件下能获得分散的单细胞或小细胞团，而结构紧密的愈伤组织较难达到上述目的。为了得到适合悬浮培养的愈伤组织，可调节其培养基成分或激素种类、浓度等，如有时提高培养基中2,4-D的浓度或降低细胞分裂素类激素（包括6-BA、KT等）会使愈伤组织变得松散。适合于愈伤组织培养的培养基不一定适合悬浮 细胞培养 ，因此必须寻找能促进悬浮培养物快速生长、有利于细胞分散的培养基，其中激素的种类和浓度往往起着重要作用。一般来说，一种植物的悬浮培养细胞要经过若干代后生长及生理特性才能稳定下来，这时方可用于 生物 转化。 1.2 微 生物 转化体系 微生物种类的来源或者购自菌藏中心（如中国科学院微生物研究所的普通微生物菌种保藏管理中心，中国农业科学院土壤肥料研究所农业微生物菌种保藏中心，等等），或者自行采集土样等基质进行分离。微生物的培养一般采用“两步发酵法”(two-stage fermentation)。首先将微生物自固体斜面培养基上接种于灭菌的液体培养基中，于摇床上培养3 d左右，成为种子液，亦称I期培养物(stage I culture)。移取适量种子液加入到新鲜的液体培养基中，接种量一般为5%-15%(体积比)。再经过1-2 d的培养，使微生物处于旺盛生长期，即为II期培养物，此时，可将底物加入其中。 2 底物的添加 生物转化的研究过程一般是先将植物细胞或微生物等接种于摇瓶中进行液体预培养，大多俟其处于对数生长末期到静止期时加入底物。底物可以固体粉末的形式加入，亦可以适量的溶剂溶解后加入。若底物水溶性差，则可以尽量小体积的乙醇、丙酮、二甲基亚砜等有机溶剂溶解，但有机溶剂在培养液中的终浓度不宜超过1%，以免影响酶的活性。底物的加入量对转化率有一定的影响，一般为每升培养液中加入30-100 mg即可，在工业化生产中底物的浓度往往较大，有些高达1.0 g·L -1 ，甚至更高。对于一些水溶性较差的底物，一般采取粉末的形式加入，如甾体的生物转化；也可以辅助添加表面活性剂；或采用b-cyclodextrin形成包合物后再添加入培养体系中。 3 转化体系的筛选—预试验 对于一个天然产物，在进行制备量生物转化之前，应该进行大量的转化体系的筛选(screening)，以确定对该化合物转化能力最强的植物培养细胞或微生物菌株。在转化体系筛选过程中，设立合适的对照组非常重要，有助于排除结果的假阴性和假阳性，从而对转化结果作出正确的判断。 3.1空白培养液对照组(blank culture control) 按照与实验组相同的条件接种、培养植物细胞或微生物，但不加入底物只加等量溶解底物的溶剂。该对照组的设立有助于排除微生物自身产生的次生代谢物对实验结果的干扰。 3.2 空白底物对照组(blank substrate control) 将底物加入到未接种植物细胞或微生物的空白无菌培养基中，按与实验组相同的条件培养、处理。该对照组有助于确定转化反应的发生是微生物催化的结果，还是由于底物本身在培养基中不稳定所致。 3.3 生物转化组 将底物按一定的浓度加入培养体系中，反应一段时间后（一般2-10 d），经离心或过滤的方法将培养物和培养液分开，培养物最好用溶剂清洗2-3遍，滤液用食盐饱和后再用合适的溶剂如氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等萃取3-5遍，合并萃取液，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩后，进行TLC或HPLC法甚至HPLC二极管阵列检测及LC-MSn法与上述空白组对比检测；另外，培养物干燥后，用适当的溶剂提取（如冷浸超声）2-3遍，提取液减压浓缩后重复上述过程。通过上述工作，筛选出对底物有较强能力的培养体系（为获得更多的衍生物）或能够将底物转化为目的产物的培养体系（为获得目标产物）供下一步的制备生物转化。 4 制备(scale-up)生物转化及产物的提取、分离及鉴定 在上述工作的基础上，选定进行生物转化的培养体系，扩大培养规模，在相同培养条件下进行生物转化，其处理过程同预试验。提取物（包括培养液和培养物的提取物）进行常规色谱分离（包括制备HPLC）出各个产物及回收底物，换算出产物的得率与底物的回收率。然后利用核磁共振 波谱 （NMR）、质谱（MS）、红外光谱（IR）、紫外光谱（UV）、旋光光谱（CD）等 波谱 手段进行产物的结构鉴定。 5 不同影响因子及反应动态的考察 如果要考察不同底物添加浓度、底物添加时期等因素对生物转化反应的影响时，则需要结合HPLC等定性与定量分析手段，获得最佳因子组合；如考察反应动态时，则在反应进程中不同时间取样，然后进行HPLC进行分析，获得有效得到所需产物的最佳反应时间。其他因子的考察可以参考上述所采用的方法。