酵母免疫荧光染色--Immunofluorescent Staining of Yeast:SDS Permeabilization Metho

Materials:  1)  1.0M  KPO4  pH  6.5  :    Make  by  mixing  33  mls  of  1M  K2HPO4  with67 mls of 1M KH2PO4  2)  0.1M  KPO4 pH 6.5  3)  0.1M  KPO4  pH  7.5:  Make  500  mls  by  mixing  41.7  mls  of  1MK2HPO4  and  8.3  mls  of  1M  KH2PO4  with  450  mls  of  ddH2O  4)  37%  Formaldehyde  5)  KS  Buffer:  0.1  M  KPO4  pH  7.5/1.2  M  Sorbitol  6)  Zymolyase  100T:    5  mg/ml  solution  in  0.1M  KPO4/0.5%  β-mercaptoethanol  7)  β-mercaptoethanol  8)  HS  Buffer:  0.1  M  Hepes  pH  7.4/1.0  M  Sorbitol  9)  HS/SDS  Buffer:  0.1  M  Hepes  pH  7.4/1.0  M  Sorbitol/0.5%  SDS10)  0.1  %  Polylysine  (MW  >300,000;  Sigma  Cat.  No.  P-1524)  Storedin  1ml  or  10  ml  aliquots  at  -20°C.    After  thawing  microfugealiquot  for  5  min.  at  4°C  before  adding  to  slides.11) Multiwell  teflon  masked  slides  (Carlson  Scientific  Inc.  PeotoneIL.  Cat.  No.100806)12) PBT  Buffer:  PBS  with1  mg/ml  BSA  and  0.02%  Tween  2013) PrimaryAntibodies:  Affinity  purified  polyclonal  antibodies  or                                 monoclonal  antibodies  from  cell  culture  supernatant  (notfrom    ascites  fluid).    Dilutions  must  be  determined  emperically  for  eachprimary  but  common  ranges  are  for  affinity  purified  sera  1:10to  1:100  in  PBT  Buffer.  For  cell  culture  supernatants  1:1  to  1:5dilutions  are  normally  used  (if  cell  supernatants  wereconcentrated  by  ammonium  sulfate  precipitation  then  1:10  to1:50dilutions  are  often  used).    After  diluting  in  PBT  buffer  spinsecondary  in  microfuge  (at  4°C)  for  5  min  to  pellet  any  debris.14) SecondaryAntibodies:  Jackson  Immunoresearch  Laboratories                                     makes  high  quality  secondary  antibodies  which  are  good  forboth  single  and  double  labeling  experiments.  We've  been  using:Texas  Red  conjugated  AffiniPure  Donkey  Anti-Mouse  IgG(Cat#715-075-141)  and  Fluorescein  (DTAF)  conjugatedAffiniPure  Donkey  Anti-Rabbit  IgG  (Cat#711-015-132).    Theyare  sent  as  freeze-dried  powder  which  should  be  reconstitutedwith  ddH2O  according  to  directions  and  then  aliquoted  into  50µl/tube  (marked  with  name  of  Ab  and  Date)  and  frozen  on  dry       ice  and  stored  in  the  "Secondary  Antibodies"  Box  in  the  -80°CFreezer.  After  thawing  an  aliquot  keep  it  at  4°C--it  should  begood  for  about  a  month.    These  secondary  Abs  work  very  wellfor  both  double  and  single  labeling  and  should  be  used  at  1:50to  1:100  dilutions  each  (in  PBT  buffer).  After  diluting  in  PBTthe  solution  should  be  microfuged  for  5  min  at  4°C  to  removeany  precipitates  that  may  have  formed.15) Mounting  Medium:    Dissolve  10  mg  of  ρ-phenylenediamine(Sigma  Cat.  No.  P-6001)  in  1  ml  of  1M  K2HP04 in  a  1.5  mleppendorf  tube.    Vortex  vigorously  for  several  minutes,  coverwith  foil,  and  rock  on  nutator  for  20-30  minutes.    Vortex  againand  microfuge  for  5  min.    Remove  the  top  800  µl  to  a  15  mltube.    Add  7.2  ml  of  glycerol  and  mix  by  vortexing.    Divide  into500  µl  aliquots  and  store  at  -80°C  (in  the  "Secondary  Ab"  Box).  Optional:  For  nuclear  staining  DAPI  can  be  added  to  mountingmedium  as  follows:    make  a  1  mg/ml  DAPI  (4',6-diamidino-2-phenylindole  dihydrochloride)  solution  in  water,  dilute  it  1:100with  water  and  add  2.25  µl  to  1  ml  of  mounting  media.Method:1)    For  each  strain  to  be  examined  inoculate  50  mls  of  YPD  or  SD(with  the  appropriate  amino  acid  supplements).  Grow  overnight  at25°C  until  culture  is  at  a  OD599  between  0.5  and  0.8.    For  examingunshifted  cells  proceed  directly  to  Step  2.    For  examining  sec7ts andsec6ts  strains  spin  cells  out  of  YPD  at  OD599  of  0.5-0.6  and  resuspendin  the  same  volume  of  YP  with  0.2%  Glucose  and  then  incubate  in  a37°C  shaking  water  bath  for  2  hrs.  Check  OD599  and  then  cool  for  5min  on  ice  until  the  culture  is  at  room  temperature  before  fixing.2 ) Fix  yeast  directly  in  the  culture  by  adding  to  each  50  mls  ofculture:  5  mls  of  1.0  M  KPO4 pH  6.5  and  6  mls  of  37%  Formaldehydedirectly  to  the  culture  flask.    Incubate  at  room  temperature  withgentle  shaking  for  30  min.    Transfer  an  amount  of  cells  that  is  equalto  about  5-10  OD599  units  for  each  culture  into  a  50  ml  centrifugetube  and  spin  in  the  Beckman  table-top  centrifuge  for  5  min.  at  2000RPM  at  25°C.    Aspirate  off  the  supernatant  and  resuspend  each  pelletin  5  mls  of  0.1  M  KPO4  pH  6.5  and  transfer  to  a  15  ml  centrifugetube.    Add  0.6  mls  of  formaldehyde  to  each  tube  and  incubate  atroom  temperature  for  1.5  hrs  with  gentle  rocking.3)    Harvest  fixed  cells  by  centrifuging  at  2.2K  RPM  for  5  min.  at25°C.    Aspirate  off  supernatant  and  resuspend  in  5  mls  of  0.1  M  KPO4pH  7.5  and  repeat  spin.    Aspirate  off  sup.  and  resuspend  cells  in  5mls  of  0.1  M  KPO4/1.2  M  sorbitol.    Fixed  cells  can  now  be  storedovernight  (or  for  several  days)  at  4°C.4 ) Prepare  Zymolyase  solution  by  dissolving  2-5  mg  of  Zymolyasein  0.1  M  KPO4  pH  7.5  to  give  5  mg/ml  solution.  Add  β-mercaptoethanol  to  0.5  %  (i.e.  5  µl/ml),  mix  by  gently  vortexing  andlet  sit  at  room  temp.  for  20-30  min  to  dissolve.5)  Harvest  fixed  cells  at  2.2K  RPM  for  5  min.    Aspirate  offsupernatant  and  resuspend  in  1  ml  of  0.1  M  KPO4  pH  7.5/1.2  MSorbitol.  Transfer  cells  to  a  13x100  mm  glass  culture  tube  (i.e.  bluecapped  tubes).  Add  45  µl  of  5  mg/ml  Zymolyase  solution  and  5  µl  ofβ-mercaptoethanol  and  incubate  at  30°C  for  30  min  with  occassionalmixing  by  finger-flicking.6)  Harvest  spheroplasts  at  2.2K  RPM  for  5  min  at  25°C.    Resuspendcells  in  3  mls  of  HS  Buffer  and  spin  at  2.2K  RPM.    Aspirate  offsupernatant  and  repeat  wash  one  time.7 ) To  permeabilize  cells  resuspend  spheroplasts  in  3  mls  ofHS/SDS  and  incubate  at  room  temperature  for  5  min.    Centrifuge  at2.2K  RPM  for  5  min  and  resuspend  cells  in  3  mls  of  HS  Buffer  andspin  at  2.2K  RPM.    Aspirate  supernatant  and  repeat  wash  with  HSBuffer.    Resuspend  cells  in  1  ml  of  HS  Buffer.    Do  not  store  the  cellsfor  more  than  a  few  hours  at  this  stage.8 ) Set  up  an  aspirator  with  "pulled"  pasteur  pipette  at  the  endnear  to  where  the  slides  are  to  be  processed  to  speed  up  the  washingprocedures.    Prepare  slides  by  adding  20  µl  of  0.1%  polylysine  toeach  well  and  incubate  for  5-10  min.  Aspirate  off  and  wash  each  well3  times  with  one  drop  of  ddH2O.9)  Place  20  µl  of  spheroplasted/permeabilized  cell  suspension  oneach  well.    Incubate  for  5-10  min.    Aspirate  each  well  and  add  onedrop  per  well  of  PBT  Buffer.  Repeat  twice  and  let  sit  while  primaryAb  dilutions  are  prepared.10) Prepare  dilutions  of  primary  antibodies  in  PBT  and  microfugebefore  use.  Add  20  µl  of  diluted  primary  antibody  and  transfer  slidesto  a  plastic  box  with  a  moistened  paper  towel  at  the  bottom.Incubate  60-90  min.11)    Carefully  remove  slides  from  box  to  benchtop  for  washing.    Towash  slides  rapidly,  hold  aspirating  pipette  in  one  hand  and  anotherpastuer  pipette  with  a  rubber  bulb  containing  PBT  Buffer  in  theother  hand.    For  each  well  aspirate  the  liquid  and  then  add  one  dropof  PBT,  aspirate  add  PBT,  repeat  this  twice  (leaving  the  well  with  adrop  of  PBT)  and  then  move  on  to  the  next  well.    It  is  important  thatthe  wells  do  not  dry  out  once  antibodies  have  been  added.    Once  allthe  wells  have  been  washed  move  on  the  next  slide.    Then  repeatthis  entire  procedure  twice  so  that  each  well  has  been  washed  atleast  nine-times.    This  may  seem  excessive  but  it  often  dramaticallyincreases  the  quality  of  the  images  obtained  and  once  you  get  thehang  of  using  both  hands  it  can  be  done  fairly  quickly.12) Wrap  plastic  box  used  for  primary  Ab  incubations  in  foil  so  it  islight  tight.    Place  slides  inside  and  place  20  µl  of  secondary  antibodyin  each  well.    Incubate  for  60-90  min  at  room  temperature.13) Wash  the  wells  as  before  with  a  total  of  at  least  9-10  washes  ofPBT  Buffer.    Aspirate  the  wells  dry  after  the  last  wash  and  let  air  dryunderneath  a  piece  of  foil  (make  a  tent)  for  10-15  min.14) Place  4  evenly  spaced  small  drops  of  mounting  medium  inbetween  the  two  columns  of  wells  in  the  middle  of  the  slide.Carefully  place  the  coverslip  over  the  slide  and  let  mounting  mediumspread.  Seal  the  slides  with  nailpolish,  let  dry  10-15  min.    Then  rinseoff  slides  with  ddH20,  dry  with  a  kimwipe  and  view  immediately  orstore  in  dark  at  -20°C.For  More  information  and  alternative  methods  see:"Immunoflourescence  Methods  for  Yeast"  by  Pringle  et.al  on  pg.  565in  GuidetoYeastGenetics  andMolecularBiology  edited  by  Guthrie                                                                            and  Fink  (Vol.  194  of  Methods  in  Enzymology).