Immunofluorescence in yeast-酵母免疫荧光

Spin  2  ODU  of  cells  3000rpm,  5' Resuspend  in  5ml  of  0.1M  KPi  pH  7.0 Add  0.6ml  37%  formaldehyde  and  rotate  (on  nutator)  at  r.t.  for  2  hrs. (can  store  cells  fixed  at  4'C  O/N) Spin  down  cells  (2500  rpm,  2') Wash  2x  in  5ml  0.1M  KPi  pH  7.0 Wash  1x  in  5ml  1.2M  Sorbitol  in  0.1M  KPi  pH  7.0 Resuspend  in  1ml  1.2M  Sorbitol/0.1M  KPi  pH  7 Add  5ul  B-mercaptoethanol  and  45ul  of  10  mg/ml  zymolyase Incubate  45'  in  30'C  incubator  (shake  tubes  once  in  a  while) Spin  and  wash  cells  in  5ml  1.2M  Sorbitol/0.1M  KPi  pH  7 Resuspend  cells  in  1ml  1.2M  Sorbitol/0.1M  KPi  pH  7 (can  store  cells  like  this  at  4'C  O/N  ) Staining: Clean  slides  in  ddH2O  and  acetone. Dilute  1%  (w/v)  polylysine  10-fold  in  water Put  15  ul  dil.  polylysine  per  well  for  5'            (Pour  MeOH  and  acetone  into                                                                     Coplin jars at -20'C) Aspirate  off  liquid  w/  drawn  out  Pasteur Wash  3x  in  distilled  water Add  15  ul  of  fixed  cells  to  each  well  for  10'  (r.t) Aspir.  liq.  and  plunge  immed.  into  -20  MeOH  for  6'  then  acetone  (-20) for  30  seconds. Air  dry  slides. Put  1  drop  BSA/PBS    (1x  PBS  +  10  mg/ml  BSA)  in  ea.  well  for  5'  (r.t) Aspir.  liq. Dilute  primary  Ab  in  BSA/PBS Add  15  ul  of  primary  Ab  to  each  well Incubate  slides  in  moist  chamber  for  approx.  2  hrs  (r.t) Wash  wells  (by  aspiration)  4x  with  BSA/PBS Dilute  secondary  Ab  in  BSA/PBS Add  15  ul  of  secondary  Ab  to  each  well Incubate  slides  in  moist  chamber  in  dark  for  2  hrs.  (r.t) Wash  4x  in  BSA/PBS Air  dry  slides Add  mounting  medium  to  slide   1  mg  phenylenediamine(-prevents  quenching  of  fluor)   first  add  100  ul  1M  KPi  (  monobasic)  then  after  it  goes  into  solution,  add 900  ul  of  glycerol  (100%)   Coverslip  the  slide  and  seal  with  nail  polish.  Store  at  -20  C

上一篇：酵母免疫荧光染色--Immunofluorescent Staining of Yeast:SDS Permeabilization Metho   下一篇：贴壁细胞和悬浮细胞免疫荧光染色方法