组织与细胞蛋白样品的制备

相关专题   1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 组织和细胞的来源： 1.1.2 仪器设备 机械组织匀浆器 低温高速离心机 (>40,000 g) 超速离心机 超生细胞破碎仪 超纯水装置 1.1.3 试剂 三氯醋酸 (TCA) 丙酮 二硫苏糖醇 (DTT) 尿素 CHAPS PMSF EDTA 乙醇 磷酸 考马斯亮蓝R350 抑肽素A 亮肽素 试剂纯度均应是分析纯或以上。 1.1.4 溶液配制 (1) PBS： NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2HPO4 1.44 g, KH2PO4，溶于800 ml水中，用HCl调pH至7.4，用纯水定容至1 L； (2) EDTA 储存液： 18.61 g Na2EDTA·2H2O，溶于70 ml纯水中，用10 mol/L NaOH调节pH值至8.0 (约需2 g NaOH颗粒)，定容为100 ml。可高压灭菌后分装备用； (3) 亮肽素储存液 (50 μg/ml，100×) 10 mg/ml溶于水，-75℃保存；使用时配成50 μg/ml储液，-20℃保存； (4) 抑肽素储存液 (70 μg/ml，100×) 1 mg/ml溶于甲醇，-75℃保存；使用时配成70 μg/ml储液，-20℃保存； (5) PMSF储存液 (10 mM, 100×): 17.4 mg PMSF，溶于1ml异丙醇中，-20℃ 保存。 (6) DTT 储存液 (1 M): 0.31 g DTT溶于2 ml H2O中，-20℃ 保存 (DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理，可过滤除菌)。 (7) 裂解液: Lysis buffer A (9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors) Lysis buffer B (7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors) Lysis buffer C 40 mM Tris-base (pH 9.5) in ultrapure H2O Lysis buffer D (8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris(base), 40 ml) Lysis buffer E (5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors) Lysis buffer F 100 μL SDS sample solution (1% w/v SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM DTT, 25% v/v glycerol) ●CA、蛋白酶抑制剂混合物和DTT在临用前加入。 (8) 蛋白酶抑制剂混合物