氨基酸的纸层析的原理和操作方法

一、目的和要求

1.学习分配层析的原理和方法。

2.掌握氨基酸纸上层析法的操作技术（包括点样、平衡、展层、显色、鉴定）。

二、原理

层析法又称色层分离法、色谱法。是一种分离分析多组分混合物质的极有效的物理及物理化学分析方法。

色谱法是目前各种化学分离法中最重要的一种方法。由于其分离效能高、分离速度快，试样用量少等特点，已经成为在与化学有关的一切领域中广泛应用的一种分离技术

纸层析是以滤纸为载体（惰性支持物）的分配层析。什么是分配呢？一般把物质在两种互不相溶的溶剂之间的溶解过程称为分配。达到平衡时，两种溶剂中所溶解的溶质的浓度之比称为分配系数，又称平衡常数。

一个物质在某溶剂系统中的分配系数，在一定温度下是一个常数。

滤纸纤维与水有较强的亲和力，滤纸纤维能吸附25-29%的水分，其中6-7%的水以氢键与纤维素的羟基结合，在通常条件下较稳定，不易除去。这种水分组成为固定相。而有机溶剂与滤纸的亲和力甚弱，因而有机溶剂为流动相（在纤维间空隙中流动），它沿着滤纸移动。溶剂由下向上移动的，称上行法；由上向下移动，称下行法。

将样品在滤纸上（此点称为原点）进行展层，样品中的各种溶质（如各种氨基酸）即在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同，不同溶质随流动相移动的速率不等，于是就将这些溶质分离开来，形成距原点不等的层析点。

溶质在滤纸上移动的速率用Rf值表示：

原点到层析点中心的距离

Rf= ————————————

原点到溶剂前沿的距离

只要条件（如温度、展层溶剂的组成、滤纸的质量等）不变，Rf值是常数。故可根据Rf值作定性分析。

三、 试剂与器材

（一） 试剂

1、酸性展开剂：4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。将20毫升正丁醇和5毫升醋酸放入分液漏斗中，与15毫升水混合，充分震荡，静止后分层，放出下层水层。取扩展剂倒入培养皿中备用。

2、显色剂：0.1%茚三酮显色液：称取0.1g茚三酮，溶于100ml正丁醇中。

3、未知氨基酸溶液

4、标准氨基酸溶液。

（二）器材

1、毛细管。

2、标本缸。

3、新华滤纸一号。（如果滤纸不干净，可用0.4mol/LHCL浸包20小时或过夜后，用 蒸馏 水洗至中性，再用95%乙醇冲洗，晾干后用。）

4、喷雾器。

5、培养皿。

6、分液漏斗。

7、电吹风。

四、操作

1、层析滤纸的准备

在15cm×20cm的滤纸上一端距边缘3cm处用铅笔轻轻划一条直线，在此直线上每间隔3cm做一记号。

2、点样：用毛细管将各 氨基酸 样品分别点在这四个位置上；每点完一次后，吹干再点第二次。点的直径应小于0.5cm，每点共点三到四次。

3、平衡与展开

将滤纸缝成圆筒形（注意纸的二边不相碰），挂在层析缸盖内的钩上，盖好盖子饱和20～30min。然后将滤纸筒放入盛有展开剂的培养皿中（点样的一端在下，展开剂的液面需低于点样线1cm），待溶剂前沿上升到离顶端1cm时取出，吹干至无正丁醇气味为止,用铅笔画出溶剂前沿界线。

4、显色：用0.1%茚三酮溶液均匀喷雾显色，65℃烘干或吹干即可显出各种 氨基酸 的层析斑点。

五、定性鉴定

计算各种氨基酸的R f 值，与各种氨基酸的标准Rf值（25±1℃）见主要参考书1的p49表2-4）对照鉴定是什么氨基酸。

六、注意事项

1、 滤纸 要保持清洁，操作时勿用手接触，载手套或只拿边角。

点样斑点要尽量小，最大不超过0.5cm的直径，每次点样后用冷风吹干再点第二次。

2、展开时点样点不要浸入有机溶剂中，至少要平衡半小时或1~2小时。

3、显色时喷雾要均匀小点，不均匀会将斑点（溶质）冲下来。

4、溶剂必须新鲜配制并摇匀才能使用。