分子克隆载体

载体（vector）是指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。载体同外源DNA在体外重组成DNA重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。

因此，作为载体应该满足以下几方面的要求：

①有某种限制酶的一个切点，最好是有许多种限制酶的切点，而且每种酶的切点只有一个；

②外源DNA插入后不影响载体在受体细胞中进行自我复制，载体应对受体细胞无害，以及载体能接纳尽可能大的外源DNA片段；

③有利于选择的标记基因，可以很方便地知道外源DNA已经插入，以及把接受了载体的受体细胞选出；

④具有促进外源DNA表达的调控区。

重组DNA技术中最常用的载体有质粒、噬菌体λ，柯斯质粒（cosmid）和噬菌体M13。它们的受体细胞都是大肠杆菌。

这四种载体的大小和结构尽管各不相同，但它们的共同特点是：

①都能在大肠杆菌中自主复制，而且能连同所带的外源DNA一起复制；

②都很容易同细菌DNA分开并加以纯化；

③都有一段DNA对于它们自身在细菌中的增殖不是必需的。因此，外源DNA可以插入这一段DNA中，或是置换这一段DNA而不影响载体的复制。根据这一特点，载体又可分成插入型和置换型两大类。

一、质粒

质粒（plasmid）是许多种细菌中发现的染色体外的遗传因子，它是闭合环状的双链DNA分子，大小从1kb直到200kb以上。质粒所带的基因通常有利于宿主细胞。例如基因的产物是某些抗生素或对某些抗生素的抗性、能降解某些复杂的有机化合物、产生大肠杆菌素和肠毒素、产生限制酶或修饰酶等。

在天然条件下，许多种质粒是通过类似于细菌接合的过程传递给新的宿主。在实验室条件下，质粒则可通过转化过程进入受体细胞。此时，受体细胞已经过处理而处于感受态，即它的细胞暂时易于让小的DNA分子透过。受体细胞由于质粒的进入而产生了新的表型。如对某种抗生素的抗性，这样就可用这种抗生素作为选择条件，选出被质粒转化的受体细胞。

质粒复制时利用宿主细胞复制自身染色体的同一组酶系。有些质粒处于“严紧控制”之下，即它们的复制是同宿主细胞的复制偶联同步的。因此在每个细胞中的质粒只有一份拷贝，或最多只有几份拷贝。这称为“严紧型”质粒。另一些质粒则是处于“松弛控制”之下的“松弛型”质粒。

每个细菌中可以有10～200份拷贝。更重要的是松弛型质粒的拷贝数，可因宿主细胞停止合成蛋白质而增加至几千份。宿主细胞不合成蛋白质时，染色体和严紧型质粒的复制都中止。但松弛型质粒仍继续进行复制。因此在增殖松弛型质粒时，总是要让宿主菌经氯霉素处理（在培养液中加入适量的氯霉素）抑制蛋白质的合成。

图23-3　pBR322的基本结构

（一）大肠杆菌质粒

应用的最广泛的质粒载体是pBR322，它属松弛型质粒，有抗氨苄青霉素和抗四环素两个抗性基因可作为标记基因，有许多种常用的限制酶的切点。它全长4352个核苷酸，排列顺序已全部测定，基本结构如图23-3。

当需要用pBR322来克隆BamHI酶切的一个DNA片段时，一般的做法是如图23-4所示。

图23-4　pBR322克隆DNA片段的程序