高效液相色谱法测定脂溶性维生素

一、实验目的 1.熟悉高效液相色谱的原理及分析方法。 2.掌握高效液相测定脂溶性维生素的方法。 二、实验原埋 样品中的维生素A 及维生素E 经皂化处理后，将其不可皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相色谱法C18反相柱将维生素A 和维生素E 分离，经紫外检测器检测，并用内标法定量测定。该法最小检出量分别为：VA：0.8ng ；α-E：9l.8ng ；γ-E：36.6ng ；δ-E：20.6ng. 三、 仪器 和试剂 仪器 高压液相色谱仪带紫外分光检测器、旋转蒸发器、高速离心机；小离心管：具塑料盖1.5~3.0mL塑料离心管(与高速离心机配套)、高纯氮气、恒温水浴锅、紫外分光光度计。 2. 试剂 实验用水为蒸馏水。 试剂 不加说明为分析纯。 1.无水乙醚：重蒸，不含有过氧化物。 过氧化物检查方法：用5mL 乙醚加1mL 10%碘化钾溶液，振摇1min。如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色或加4滴0.5%淀粉液，水层呈蓝色。 去除过氧化物的方法：瓶中放人纯铁丝或铁沫少许，重蒸乙醚。弃去10%初馏液和10%残馏液。 2.无水乙醇：重蒸，不含有醛类物质。 检查方法：取2mL 银氨溶液于试管中，加入少量乙醇，摇匀，再加入10%氢氧化钠溶液，加热，放置冷却后，若有银镜反应则表示乙醇中有醛。 银氨溶液：加氨水至5%硝酸银溶液中，直至生成的沉淀重新溶解为止，再加10%氢氧化钠溶液数 滴，如发生沉淀，再加氨水直至溶解。 脱醛方法：将2g 硝酸银溶于少量水中，4g 氢氧化钠溶于温乙醇中，然后将两者倾入1L 乙醇中，振摇后，放置暗处两天(不时摇动，促进反应)，过滤，置蒸馏瓶中蒸馏，弃去初蒸出的50mL。当乙醇中含醛较多时．硝酸银用量适当增加。 3.无水硫酸钠。 4.甲醇：色谱纯或分析纯重蒸后使用。 5.重蒸水：蒸馏水中加少量高锰酸钾，临用前重蒸。 6.10%抗坏血酸溶液(W/V)：临用前配制。 7.50%氢氧化钾溶液(W/V) 8.维生素A 标准液：视黄醇(纯度85%)或视黄醇乙酸酯(纯度90%)经皂化处理后使用。用脱醛乙醇溶解维生素A 标准品，使其浓度大约为1mL 相当于1mg 视黄醇。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度. 9.维生素E 标准液: α-生育酚(纯度95%)，γ-生育酚(95%)，δ-生育酚(纯度95%)。用脱醛乙醇分别溶解以上三种维生素E 标准品，使其浓度大约为1mg/mL。临用前用紫外分光光度分别标定此三种维生素E 的准确浓度。 10.内标溶液：称取苯并[e]芘(纯度98%)，用脱醛乙醇配制成每5μg/mL 苯并［e］芘的内标溶液。 11.pHl－14试纸， 四、操作步骤 (一)样品处理 1.皂化 称取1～10g 样品(含维生素A 约3ng，维生素E 各异构体约为40ng)于皂化瓶中，加30mL 无水乙醇，进行搅拌，直到颗粒物分散均匀为止。加5mL 10%抗坏血酸、苯并[e]芘标准液2.00mL，混匀。再加10mL50%氢氧化钾，混匀。于沸水浴回流30min 使皂化完全。皂化后立即放人冰水中冷却。 2.提取 将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50mL 水分2~3次冲洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用约100mL 乙醚分两次洗皂化瓶及其残渣，乙醚液并入分液漏斗中。轻轻振摇分液漏斗2min，静置分层，弃去水层。 3.洗涤 用约100mL 水分次洗分液漏斗中的乙醚层，直至pH 试纸检验水层不显碱性(最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加)。