SDS-聚丙烯胺凝胶的制备方法
（一） 试剂 1. 30%丙烯酰胺 丙烯酰胺 29 g N，N’-亚甲双丙烯酰胺 1 g 蒸馏 水 100 ml 加热至50℃搅拌溶解，于4℃保存。 2．10%SDS： 蒸馏 水配制，室温保存。 3．10%过硫酸铵：蒸馏水配制，4℃保存，一周内使用。 4．TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺） 5．1.5mol/L Tris-HCl（pH8.8）和1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8） 6．电泳缓冲液 25 mmol/L Tris-HCl（pH8.0） 250 mmol/L 甘氨酸 0.1% SDS 7．电泳加样缓冲液 50 mmol/L Tris-HCl（pH6.8） 50 mmol/L 二硫苏糖醇（ DTT ） 2 % SDS 1 % 溴酚蓝 10 % 甘油
（二）操作 1．将玻璃板和垫片依次用5%的KOH甲醇溶液、去污剂和清水洗涤，晾干。将无凹口的玻璃板平放在桌面上；将垫片两面涂少许凡士林后，排放在玻璃两侧，再将有凹口的玻璃板在垫片上放置妥当。将玻璃夹层推至桌沿，用胶带纸封闭三个侧面，留出有凹口的一面不封闭。 2．使玻璃夹层竖立，有凹口面朝上。根据所需的凝胶浓度和用量，按表7-1的比例配制分离胶溶液 3．一旦加入TEMED，混匀后立即小心将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，为积层胶留有足够空间。用吸管轻轻在其顶层加入几毫升异丁醇，以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。 4．聚合完成后（约30～60分钟）后，倒掉覆盖液体，用蒸馏水洗凝胶上部数次，尽可能用吸水纸吸干凝胶顶端的残余液体 5．根据所需用量，按表7-2的比例配制积层胶溶液。 6．注入积层胶溶液，插入梳子，小心避免气泡，垂直放置于室温下。 7．在积层胶聚合完成（约30分钟）后，小心拔掉梳子。用蒸馏水冲洗梳孔以除去未聚合的丙烯酰胺。 8．将凝胶放入电泳槽中，上下槽均加入1×电泳缓冲液，检查是否泄漏。驱除两玻璃板之间凝胶底部的气泡，即可上样。
表7-1 配制SDS-PAGE凝胶电泳分离胶浓度与所用溶液量
溶液成分 | 5～50ml凝胶溶液中各成分所需体积（ml） | ||||||
10 | 15 | 20 | 25 | 30 | 40 | 50 | |
12% 凝胶溶液 H 2 0 30%丙烯酰胺 1.5mol/L Tris -HCl (pH8.8) 10%SDS 10%过硫酸胺 TEMED
15% 凝胶溶液 H 2 0 30%丙烯酰胺 1.5mol/L Tris -HCl (pH8.8) 10% SDS 10%过硫酸胺 TEMED |
3.3 4.0 2.5 0.1 0.1 0.004
2.3 5.0 2.5 0.1 0.1 0.004 |
4.9 6.0 3.8 0.15 0.15 0.006
3.4 7.5 3.8 0.15 0.15 0.006 |
6.6 8.0 5.0 0.2 0.2 0.008
4.6 10.0 5.0 0.2 0.2 0.008 |
8.2 10.0 6.3 0.25 0.25 0.010
5.7 12.5 6.3 0.25 0.25 0.010 |
9.9 12.0 7.5 0.3 0.3 0.012
6.9 15.0 7.5 0.3 0.3 0.012 |
13.2 16.0 10.0 0.4 0.4 0.016
9.2 20.0 10.0 0.4 0.4 0.016 |
16.5 20.0 12.5 0.5 0.5 0.020
11.5 25.0 12.5 0.5 0.5 0.020 |
表7-2 配制 SDS -PAGE凝胶电泳积层胶所用溶液量
溶液成分 | 1～10ml凝胶溶液中各成分所需体积（ml） | ||||||
1 | 2 | 4 | 5 | 6 | 8 | 10 | |
H 2 0 30%丙烯酰胺 1.0mol/L Tris-HCl (pH6.8) 10%SDS 10%过硫酸胺 TEMED | 0.68 0.17 0.13 0.01 0.01 0.001 | 1.4 0.33 0.25 0.02 0.02 0.002 | 2.7 0.67 0.5 0.04 0.04 0.004 | 3.4 0.83 0.63 0.05 0.05 0.005 | 4.1 1.0 0.75 0.06 0.06 0.006 | 5.5 1.3 1.0 0.08 0.08 0.008 | 6.8 1.7 1.25 0.1 0.1 0.010 |
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