cDNA文库构建的过程

cDNA文库构建的过程分为六个阶段：

阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链

阶段2：cDNA第二链的合成

阶段3：cDNA的甲基化

阶段4：接头或衔接子的连接

阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDN

阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接 阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链 1.在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA第一链的合成：

poly(A) RNA (1μg/μl) 10μl

寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl

1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃) 2.5μl

1mol/L KCl 3.5μl

250 mmol/L MgCl2 2μl

dNTP溶液（含4种dNTP，每种5mmol/L） 10μl

0.1 mol/L DTT 2μl

RNase抑制剂（选用） 25单位

加H2O至 48μl

2.当所有反应组在0℃混合后，取出2.5μl反应液转移到另一个0.5ml微量离心管内。在这个小规模反应管中加入0.1μl [α-32P] dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）。

3.大规模和小规模反应管都在37℃温育1h

4.温育接近结束时，在含有同位素的小规模反应管中加入1μl 0.25mol/L EDTA，然后将反应管转移到冰上。大规模反应管则在70℃温育10 min，然后转移至冰上。

5.参考《分子克隆实验指南》第三版附录8所述方法，测定0.5μl小规模反应物中放射性总活度和可被三氯乙酸（TCA）沉淀的放射性活度。此外，用合适的DNA分子质量参照物通过碱性琼脂糖凝胶电泳对小规模反应产物进行分析是值得的。

6.按下述方法计算cDNA第一链的合成量（推算方法略）：[掺入的活度值(cpm)/总活度值]×66(μg)=合成的cDNA第一链(μg)

7.尽可能快地进行cDNA合成的下一步骤。