大片段DNA的琼脂糖凝胶回收

大片段：指的是片段大小超过10kb的DNA 片断，由于越长的DNA 分子和纯化膜的结合力越强，洗脱力越差，在离心过柱时可能被“扯断”，因此常规的离心过柱的方法并不适合大片段DNA 的回收。在凝胶电泳的大片断回收，特别是几十kb的大片断，经典方法是电洗脱。

此外，低熔点琼脂糖和琼脂糖酶消化也是常常有人选用的方法，新兴的方法是用玻璃奶或者纯化填料。其实无论用什么方法，在回收大片断时一定要牢记你对付的是大片断，操作时一定要小心注意，粗暴的操作，最后结果也是自己来承受的。

这些方法中，速度最快的就是玻璃奶或者纯化填料珠的试剂盒了。毕竟，谁愿意为一个小小的胶回收浪费2个多小时呢？有那功夫干点别的不好？我最早用的其实是当时的Pharmacia（后来改为Amersham，现在是GE Healthcare Life Sciences）的一个玻璃奶（Glassmilk）试剂盒。

现在记得Glassmilk的人应该不多了，在当时却是我们眼中的神奇宝贝――半个多小时就可以完成本来要搞2个多小时的活：溶胶液溶胶后，加入10ul混匀的玻璃奶溶液，混匀静置吸附后，离心去上清，再清洗1―2次，干燥，最后用洗脱液洗脱，离心取上清即可。

1.QIAEX II

产地：Qiagen

回收范围：40bp-50kb

特点：

通用性高：一般或者低熔点琼脂糖凝胶，TAE或TBE，以及聚丙烯酰胺凝胶

无NaI干扰后续实验

大片段DNA 保存较好，不会被剪切

使用心得：

这个试剂盒不同于Qiagen其它的胶回收试剂盒，利用的是配合高离液盐（chaotropic salt）的silica-gel particles，因此QiaEX可以从盐，琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，染料，蛋白以及核苷酸中无需苯酚抽提或者酒精沉淀即可获得纯化DNA 片段。

这个试剂盒使用方法和玻璃奶的试剂盒基本一样，区别在于玻璃奶是粉碎的玻璃，因此可能存在大小不一、边缘尖锐等情况，在离心力下，大小不同的碎片的沉降系数不同而导致在沉淀中分布位置不同，当长片断一头粘附在大片断一头吸附在小片断上，离心产生的剪切力就会导致长片断的断裂。而QiaEX的纯化填料是人工特制的大小均一的球形小珠（Beads），能更好的吸附DNA ，也不易产生上述的剪切力问题，使得回收的大片断DNA 更为完整。

无论是玻璃奶还是纯化填料，比起过柱的方法，优点在于适用于较大范围的DNA 回收，从小片断到超级大片断都可以，适用范围广；而且每次反应可以根据估算的待回收DNA 的量来放大或者缩小纯化试剂的量，比较灵活。比如QIAEX说是150反应（每次5ug），实际上往往可以用200多次或者更多。

但是这个方法的问题有2个，一个是比较麻烦，需要一定操作经验――无论是清洗或者是最后的洗脱，离心后要尽量多取上清而不干扰沉淀，多少有点点难度，特别是最后取洗脱的DNA ，要舍得放弃最后那点上清，免得回收产物中混入了纯化介质，在后面的实验中得不偿失。所以，你可以从此想象，由于每次离心沉淀后沉淀是浸在上清溶液中的，去除始终不彻底，这就注定了这个方法纯化的产物纯度不如离心高，回收率也不如那么高。你看，QIAEX说这个回收产物可用于酶切、连接、标记和PCR，但是就没有提到显微注射芯片分析等更高要求的实验。

另一个问题是干燥的程度如何把握需要一定经验――干过头了洗脱困难，没干透就会将酒精带入后继实验――要干到沙面雪白而靠管壁的最边缘还有丁点透明就可以了。当然，这个现象描述起来不着边际，做过的人就心中了了。洗脱体积通常是20ul。操作要领除了前面提到的问题，就是离心充分，离心后取管子动作轻快，事前调好加样枪，取上清要轻，靠壁、放枪缓，动作利索，不要千万不要来回抽。舍得放弃。

QiaEX相关参数：

类似方法的产品还包括Roche的Agarose Gel DNA Extraction Kit