小麦黄化苗总DNA的提取

一、实验目的

学习和掌握DNA的微量提取法。

二、实验原理

小麦黄化苗经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如SDS），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用SDS法，其主要作用是破膜。SDS属阴离子去污剂，要溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。

SDS在溶液中带负电荷，能与带正电荷的蛋白质侧链结合成复合物，当加入钾盐时，能与SDS－蛋白质生成溶解度很小的沉淀一同去除。酚/氯仿/异戊醇的作用是去除核酸制品中的蛋白质，并有利于水相与有机相的分开，而且可以消除泡沫。异丙醇或乙醇的作用是沉淀DNA。

处理DNA样品时，可在65℃保温30min，较之37℃处理有以下优点：

①RNA酶的最适作用温度为65℃；

②DNA酶最适作用温度为37℃，当用65℃处理时，这些酶往往处于活性极低的状态而不会降解DNA；

③RNA中的某些总分会形成发卡结构，65℃处理更有利于这些结构的松散，使RNA酶的作用更完全。

三、药品

1．提取缓冲液

100mmo/L NaCl

100mmol/L Tris-Cl（pH8.0）

50mmol/L EDTA

1%疏基乙醇

2．20%SDS

3．5mol/L醋酸钾

取29.5ml冰醋酸，用KOH颗粒调校至PH4.8，加水至100ml，室温保存，不可灭菌。

4．酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）

5．异丙醇

6．70%乙醇

四、实验流程

1.称取0.1g小麦黄化苗叶片于预冷的研钵中，加入3倍体积(W/V，约300μl)提取缓冲液，在冰盘上研磨。

2.研碎后转入一EP管中，再加约300μl提取缓冲液。

3.加入20%SDS至终浓度为2%，约66μl。

4.轻轻混匀后于65℃水浴，10min。

5.加入1/10体积的5mol/L醋酸钾(约66μl)，于水浴中反应30min。

6.离心（15krpm,10min,4℃）。

7.取上相转入一新的EP管中，用等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提一次（上下晃动几次即可）。

8.离心（12krpm,10min,20℃）。

9.取上相转入一新的EP管中，加入等体积的异丙醇，于室温下反应5~10min，其间将管至少颠倒5次。

10．离心（15krpm,10min,4℃）。

11．弃上清液，用70%乙醇冲洗沉淀物，真空抽干或吹干，最后溶于1×TE中（约50μl）。

五、注意事项

1.研磨后应迅速加入提取液，因为提取液中含EDTA，能够螯合Mg2 等二价阳离子，防止破碎细胞中的DNA酶降解DNA。

2.提取过程中，转移上清液时所用的枪头最好用剪刀将尖头剪去，以避免对DNA造成的不必要的机械损伤。

3.干燥DNA时，要注意，过干或过湿都不利于DNA的溶解。

所需器材及用具

冰盘（4个）、研钵（8套）、塑料烧杯（8个）、200μl微量加样器（2把）、离心机（1台）、水浴锅（65℃）、枪头及EP管。