酶切反应(Setting Up a Restriction Endonuclease Reaction)

一、 建立一个标准的酶切反应

目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。

二、 选择正确的酶

不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。

假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。

内切酶的产物可以是粘端的（3'或5'突出端），也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。

三、 酶

内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。酶的用量视在底物上的切割频率而定。例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。参见目录第244和264之"切割质粒DNA"和"包埋法切割DNA"。

四、 DNA

待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。

五、 缓冲液

对于每一种酶NEB都提供相应的最佳缓冲液，可保证几乎100%的酶活性。使用时的缓冲液浓度应为1X。有的酶要求100μg/ml的BSA以实现最佳活性。在这种情况下，我们也相应提供100X的BSA（10mg/ml）。不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响。

六、 反应体积

内切酶活力单位的定义是：1小时内，50μl反应体积中，降解1μg的底物DNA所需的酶为一个活力单位。因此酶：DNA的反应比例可以由此确定。较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响。为了将甘油的浓度控制在5%以下，要注意酶的体积不要超过总体积的10%（一般酶都贮存于50%的甘油中）。

七、 混合

这是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反应完全，必须使反应液充分混合。我们推荐用枪反复吸取混合，或是用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心一下即可。注意：不可振荡！

八、 反应温度

大部分酶的反应温度为37℃；从嗜热菌中分离出来的内切酶则要求更高的温度。一般为50-65℃不等。Activity of thermophiles at 37℃。

九、 反应时间

1酶活单位的定义时间为1小时。如果加入的酶较多，可以相应地缩短反应时间；反之，如果加入的酶量较少，也可以延长时间以使反应达到完全。参见第241页酶在反应中的存活时间。

十、 终止反应

如果不进行下一步酶切反应，可用终止液来终止反应。在NEB我们使用如下反应终止液：50%的甘油，50mM EDTA（pH8.0），和0.05%溴酚蓝（10μl/50μl反应液）。如果要进行下一步酶切反应，可用热失活法终止反应（65℃或85℃，20分钟）。

热失活并不能适用于所有的酶，详情参见第240页热失活表。此外，酚/氯仿抽提也可以用于终止反应。

十一、贮存

大部分酶应贮存于-20℃。少部分酶则须在-70℃长期保存。详情请参见相关酶的DATA SHEET 或目录相关部分。10X BUFFER 和100X BSA于-20℃保存。BSA不能与NEBuffer混合后保存，否则将会出现BSA沉淀。

十二、稳定性

每隔1-2个月都会对所有的酶有一个活性检测；最近的一次检测结果将被贴在售出的每一管酶上。通过三十多年来的经验，我们发现大部分酶在推荐的保存缓冲液里在-20℃条件下十分稳定。高于-20℃条件下稳定性将有所降低。

十三、对照反应

如果发现您的DNA底物不能被成功切开，可以进行对照实验以查明原因。具体方法如下：

将不加内切酶的底物DNA（待切底物）与加入了内切酶的对照DNA（有多个已知酶切位点）同时进行反应。

若实验结果表明底物DNA降解，则说明DNA在纯化过程中或反应液里引入了核酸酶污染；若实验结果发现底物DNA保持完整，而对照DNA被成功切开，则可以排除酶质量的原因，此时可以将对照DNA和待切底物DNA混合起来再次进行反应，以确定样品中是否有抑制剂。

如果有抑制剂存在（通常是盐、EDTA或酚），则混合物里的对照DNA也无法被切开。