DNA 的定量与连接反应

药品试剂：

纯化的gusA 片段及pQE31 BamHI/HindIII 片段

1% 6-well agarose gel

DNA 标准分子量 （λMr, 0.5 μg/μL）

方法步骤：

1） 取4 支微量离心管，依下表加入DNA, TE-8.0 及追踪染剂 （μL）：

2） 短暂离心混合后，将各管样品置65℃水浴5~10 min 后，移至冰浴降温后进行电泳分析。

3） 将胶体置于UV transilluminator 上观察各色带的亮度，与已知量的 λMr 比较，找出分别与#3, #4 亮度相当的片段。

4） 估计 #3, #4 的DNA 量及计算每 μL 所含的莫耳数。

纯化的gusA 片段与经BamHI/HindIII 作用的pQE31 片段混合后，末端序列互补的部份会进行黏合，但仍须藉由DNA ligase 催化phosphodiester bond 的形成，将缺口接合起来。

仪器用具：12℃恒温槽

药品试剂：

纯化的gusA 片段及pQE31 BamHI/HindIII 片段

T4 DNA ligase （1 U/μL, Invitrogen）

5×T4 DNA ligase buffer （0.25 M Tris-HCl, pH 7.6; 50 mM MgCl2; 5 mM ATP; 5 mM DTT; 25% PEG-8000）

方法步骤：

1） 两种DNA 片段于65℃水浴加热10 min 后，置冰浴中。

2） 取5 支微量离心管置冰浴中，依下表所列 （单位 μL） 依序加入各成份：

* Vector 与ｉｎｓｅｒｔ 的比例为莫耳数比，DNA 总量为100 ng.

3） #1~#4 置于12℃反应过夜，#5 则不加ligase,直接置于4℃冰箱。

4） #1~#4 反应过夜后，以70℃加热10 min，置冰浴中。